La combinación de hidroxicloroquina y 2

Jul 19, 2023

Cell Death Discovery volumen 8, número de artículo: 286 (2022) Citar este artículo

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La 2-desoxiglucosa (2-DG) se puede utilizar en la investigación antitumoral al inhibir la glucólisis y promover la vía de estrés del retículo endoplásmico (ERS), pero su aplicación clínica está restringida debido a los efectos secundarios que limitan la dosis y las posibilidades de supervivencia de las células cancerosas mediante la autofagia protectora. . Por lo tanto, nuestra investigación exploró si la combinación de hidroxicloroquina (HCQ), un fármaco inhibidor de la autofagia aprobado por la FDA, y 2-DG es una estrategia terapéutica prometedora. Aquí, informamos que la HCQ combinada con 2-DG puede inhibir aún más la viabilidad y la migración e inducir la apoptosis de las células tumorales de mama en comparación con otros fármacos individuales. La combinación de 2-DG y HCQ puede reducir significativamente el tamaño del tumor trasplantado y la metástasis de células tumorales del pulmón y el hígado in vivo. A nivel celular, la HCQ suprimió la formación de autolisosomas y terminó el proceso de autofagia inducido por ERS mediado por 2-DG, lo que resultó en la acumulación continua de proteínas mal plegadas en el retículo endoplásmico, lo que generó ERS sostenido a través de PERK-eIF2α-ATF-4-. Eje CHOP y desencadenó la transformación de un proceso de supervivencia a la muerte celular. Nuestra investigación reforzó el interés de la investigación de los disruptores metabólicos en el cáncer de mama triple negativo y enfatizó el potencial de la combinación de 2-DG y HCQ como tratamiento anticancerígeno.

El cáncer de mama es uno de los tumores más comúnmente diagnosticados en las mujeres [1]. A pesar de la aplicación clínica de nuevas técnicas como la detección temprana, las imágenes y la terapia dirigida, un gran número de mujeres muere cada año debido a la progresión del cáncer de mama [2]. Los tumores de mama caninos (CMT) también son uno de los tipos de tumores de alta incidencia en perros no castrados [3]. Los CMT son uno de los mejores modelos animales para estudiar tumores humanos porque comparten características fisiológicas, genéticas y epidemiológicas similares [4]. Sin embargo, los fármacos de quimioterapia que se utilizan actualmente son limitados debido a sus fuertes efectos secundarios citotóxicos y su resistencia a los fármacos [5, 6]. Por lo tanto, se necesitan con urgencia nuevas estrategias terapéuticas seguras y eficaces.

Las células cancerosas tienen más probabilidades de obtener energía de la glucosa mediante glucólisis que las células normales, que producen ATP mediante fosforilación oxidativa [7]. Por lo tanto, la supresión de la glucólisis se considera una estrategia terapéutica potencial eficaz para los tumores de mama [8].

La 2-desoxiglucosa (2-DG) es un análogo de la glucosa y puede unirse a los transportadores de glucosa, que son proteínas clave para la absorción de glucosa, para inhibir competitivamente la absorción de glucosa e inhibir aún más la glucólisis [9, 10]. Además, 2-DG-GDP es un producto posterior del metabolismo de 2-DG, que puede interferir con la glicosilación ligada a N debido a su similitud con la manosa-GDP en su estructura [11]. Por lo tanto, 2-DG también puede inducir la acumulación continua de proteínas desplegadas/mal plegadas en el retículo endoplásmico (RE), lo que podría causar estrés en el retículo endoplásmico (ERS) y la muerte posterior [12, 13]. Por otro lado, ERS activa la autofagia protectora y media en la eliminación de proteínas y orgánulos defectuosos, lo que puede ser la razón por la cual la monoterapia con 2-DG ha arrojado pocos resultados positivos [14, 15].

La hidroxicloroquina (HCQ) se usa ampliamente en el tratamiento de enfermedades clínicas, incluidas la reumatología y las enfermedades infecciosas [16, 17]. Además, la evidencia de investigaciones recientes muestra el papel positivo de la HCQ en la investigación oncológica porque puede inhibir la autofagia al desacidificar los lisosomas [18, 19].

En este estudio, mostramos que el tratamiento combinado de HCQ y 2-DG tiene un efecto sinérgico al inhibir la viabilidad de las células 4T1 (origen de ratón) y las células CMT-7364 (origen canino) bajo el mecanismo de inhibición de la autofagia y ERS sostenida.

Como se informó anteriormente, la HCQ y la 2-DG son citotóxicas para una variedad de células cancerosas [12, 19]. Para explorar más exhaustivamente el modo de acción de los fármacos en diferentes especies de tumores de mama, elegimos las células CMT-7364 y ​​4T1, que son modelos habitualmente aplicados de tumores de mama humanos. Las células tratadas con concentraciones crecientes de HCQ o 2-DG mostraron una disminución de la viabilidad dependiente de la dosis (Fig. 1A, B). Los valores de CI50 de las células CMT-7364 y ​​4T1 tratadas con HCQ fueron >50 µM. Según estos resultados y los informes anteriores, elegimos HCQ 10 μM para estudios adicionales. A diferencia del 2-DG solo, 10 μM de HCQ combinado con diferentes concentraciones de 2-DG aumentaron la citotoxicidad (Fig. 1B). La CI50 de 2-DG en células CMT-7364 y ​​4T1 fue aproximadamente igual a 0,9853 y 0,7360 mM, respectivamente. Según estos hallazgos, se utilizó 2-DG 1 mM para experimentos adicionales.

A, B Los valores de IC50 de 24 h de HCQ y 2-DG se calcularon en células 4T1 y CMT-7364. La viabilidad celular se determinó mediante el Cell Counting Kit-8. La combinación de 2-DG y HCQ tuvo un efecto citotóxico más fuerte sobre la viabilidad celular que el 2-DG solo. n = 5 para cada grupo. Los datos se presentan como las medias ± DE de tres experimentos independientes. **p < 0,01, ****p < 0,0001, ns = no significativo (p ≥ 0,05).

Se ha demostrado que el 2-DG inhibe la proliferación celular e induce la apoptosis celular en las neoplasias de mama, pero generalmente debe combinarse con otros fármacos para obtener mejores resultados [19, 20]. En comparación con el grupo NC, el tratamiento con diferentes concentraciones de 2-DG aumentó significativamente la expresión de proteínas apoptóticas en células CMT-7364 (Figura S1). Si bien no hubo diferencias en estos niveles de expresión de proteínas entre los diferentes grupos de concentración (Figura S1), lo que sugiere los efectos secundarios limitantes de la dosis de 2-DG en las células CMT-7364. Por lo tanto, exploramos si la adición de HCQ puede reducir la dosis eficaz del fármaco de 2-DG en células CMT-7364 y ​​4T1. En comparación con el grupo NC, la viabilidad de las células CMT-7364 y ​​4T1 a las 48 y 72 h después del tratamiento con HCQ y 2-DG se inhibió significativamente, y su tratamiento combinado resultó en una menor viabilidad y densidad celular que el 2-DG solo ( Figura 2A). Este fenómeno sugiere que se produjo una muerte celular masiva.

Se utilizaron kits A Cell Counting Kit-8 para evaluar la proliferación de células 4T1 y CMT-7364 tratadas con HCQ, 2-DG o HCQ combinado con 2-DG a las 0, 12, 24, 48 y 72 h. n = 3 experimentos independientes realizados por quintuplicado para cada condición. B, C Ensayos de cicatrización de heridas de células 4T1 y CMT-7364 después del tratamiento con HCQ y 2-DG solos o en combinación durante 24 h. Se muestran imágenes representativas que representan el comienzo (t = 0 h) y el final (t = 24 h) del período de grabación. n = 3 experimentos independientes realizados por triplicado para cada condición. D, Ensayos de apoptosis de células E de células 4T1 y CMT-7364 tratadas con HCQ, 2-DG o su combinación usando FACS. Las células se recogieron y se marcaron con Anexina V‐FITC y PI. n = 3 experimentos independientes realizados por triplicado para cada condición. F, G Análisis de transferencia Western de Bax, Bcl-2, caspasa-3 escindida (C-Casp3) y PARP escindida (C-PARP) en células tratadas con HCQ y 2-DG solos o en combinación durante 24 h. Se utilizó β-actina como control interno. H Tinción de inmunofluorescencia de C-Casp3 en células 4T1 y CMT-7364, que se trataron con HCQ y 2-DG solos o en combinación durante 24 h. Barra de escala: 200 μm. n = 3 experimentos independientes realizados por triplicado para cada condición. Todos los resultados de tres experimentos independientes se expresan como la media ± DE. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, ns = no significativo (p ≥ 0,05).

Se utilizó un ensayo de cicatrización de heridas para investigar la relación entre la disminución de la viabilidad celular y la inhibición de la migración celular. No observamos el efecto de la HCQ sola, mientras que 2-DG y su combinación inhibieron significativamente la migración celular en las células CMT-7364. Por el contrario, HCQ y 2-DG solos redujeron de manera similar la migración celular en comparación con el control, y su combinación inhibió significativamente la migración celular en células 4T1 (Fig. 2B, C). Estos resultados indican que la combinación de HCQ y 2-DG suprimió fuertemente los efectos de la migración celular.

La apoptosis es un proceso regulador esencial que mantiene la homeostasis celular de las células cancerosas. Por lo tanto, las tasas de apoptosis se midieron mediante tinción con anexina V/PI. Los resultados indicaron que la apoptosis del grupo de cotratamiento con HCQ y 2-DG fue significativamente mayor que la de los grupos de control negativo y tratamiento individual (Fig. 2D, E). Además, también evaluamos los niveles de proteína de Bax, Bcl-2, C-Caspasa-3 y C-PARP, que son proteínas apoptóticas típicas en las células cancerosas (Fig. 2F, G). Los niveles de expresión de las proteínas C-Caspasa-3 se detectaron mediante análisis inmunohistoquímico (Fig. 2H). Estos resultados son consistentes con las conclusiones anteriores. En conjunto, estos resultados sugieren que la combinación de 2-DG y HCQ contribuye a propiedades antitumorales eficaces in vitro.

Para validar aún más los resultados de los experimentos in vitro, se estableció un modelo de ratón con homotrasplante subcutáneo. Como muestran los resultados (Fig. 3A-C), los volúmenes y pesos de los tumores del tratamiento combinado de HCQ y 2-DG fueron significativamente más bajos que los del control negativo después de 4 semanas de tratamiento. Los resultados de 2-DG y 1/2 2-DG combinados con el tratamiento con HCQ mostraron curvas similares. Los ratones tratados no encontraron diferencias significativas en el peso corporal en comparación con los controles (Fig. 3D). Además, examinamos las características histopatológicas de tumores y órganos vitales mediante tinción con H&E (Fig. 3E). No se observaron anomalías histopatológicas evidentes en el bazo, el corazón o el riñón, lo que mostró pocos o ningún efecto tóxico y secundario de los medicamentos en ratones. Las secciones de tumores del grupo de combinación mostraron una mayor proporción de células con núcleos fragmentados que las del grupo 2-DG, el grupo HCQ y el grupo NC, lo que ilustra cambios patológicos más graves del tumor in situ tratado con 2-DG y HCQ. Además, el grado de fragmentación nuclear en las células tumorales fue similar en el grupo de 2-DG de 100 mg/kg y en el grupo de 2-DG de 50 mg/kg combinado con HCQ, lo que sugiere la reducción de la dosis de 2-DG mediante la adición de HCQ. Estos cambios en la sección del tumor fueron consistentes con los cambios de volumen y peso del tumor en las figuras 3A a C.

Se dividieron ratones hembra BALB/c en cinco grupos y el día 15 se inició la inyección de los fármacos indicados. A – C Cada 2 días, se midieron el volumen del tumor y el peso corporal (n = 5 por grupo). D El día 40, se sacrificaron los ratones de forma humanitaria, se recogieron muestras y se midió el peso del tumor. Los datos se muestran como la media ± DE. Los símbolos ns, *, **, **** denotan diferencias significativas o no significativas (p ≥ 0,05), P < 0,05, P < 0,01, P < 0,0001 versus el grupo de control negativo, respectivamente. E Paneles representativos de tinción H&E de tumores y órganos vitales importantes, como el hígado, los pulmones, el bazo, el corazón y los riñones de ratones. Barra de escala: 50 μm. Los cuadros con borde azul en las secciones del hígado indican células 4T1 metastásicas.

Además, se observó metástasis tumoral significativa en el hígado y el pulmón del grupo de control de la inyección de PBS (la metástasis se indicó mediante los cuadros de línea azul en la sección del hígado y por las células llenas entre los alvéolos en la sección del pulmón). En comparación con la metástasis tumoral en el grupo de fármaco único y el grupo NC, los focos metastásicos en el hígado y el pulmón se redujeron significativamente en el grupo 2-DG y HCQ, lo que sugiere que la combinación de fármacos podría reducir la metástasis tumoral. Sin embargo, este resultado necesita estar respaldado por más datos experimentales, que pueden ser el énfasis de la investigación de seguimiento sobre la combinación de 2-DG y HCQ.

Además, la tinción por inmunofluorescencia de las secciones del tumor mostró que la acumulación de LC3 y Cleaved-Caspasa-3 aumentó obviamente en el grupo de tratamiento combinado de 2-DG y HCQ, en comparación con el grupo NC, el grupo HCQ y el grupo 2-DG (Figura S2). Por lo tanto, se sugirió que la combinación de HCQ y 2-DG podría mejorar la autofagia y la apoptosis en las células 4T1. Además, las intensidades de fluorescencia de LC3 y Cleaved-Caspasa-3 en células tratadas con 50 mg/kg de 2-DG combinado con HCQ fueron similares a aquellas en células tratadas con sólo 100 mg/kg de 2-DG, lo que revela que la adición de HCQ podría reducir la concentración efectiva de 2-DG (Figura S2). En conjunto, estas observaciones respaldaron que el tratamiento combinado con HCQ y 2-DG exhibe una actividad anticancerígena más fuerte in vivo.

Para investigar más a fondo los efectos anticancerígenos mejorados de la combinación de HCQ y 2-DG, se utilizó microscopía electrónica de transmisión (TEM) para observar la morfología celular. En la figura S3 se muestra el análisis estadístico cuantitativo del número de ER y vesículas autofágicas. Después del tratamiento con 2-DG, la densidad electrónica, el número y la longitud del ER en las células 4T1 y CMT-7364 aumentaron en general. Este fenómeno está en línea con investigaciones anteriores [21]. Sin embargo, después del tratamiento combinado de HCQ y 2-DG, la longitud del ER de las células 4T1 y CMT-7364 se acortó en diversos grados, mientras que la densidad y cantidad de electrones apenas cambiaron (Fig. 4A). Este descubrimiento nos impulsó a investigar las vías de respuesta de las proteínas desplegadas (UPR), mientras que la vía PERK/eIF2α/ATF-4/CHOP es la vía principal en la anafase de ERS y puede inducir directamente la apoptosis [22, 23]. El grupo de cotratamiento indujo dramáticamente la expresión de Grp78, p-PERK, p-eIf-2α, ATF-4 y CHOP en comparación con el grupo NC y el grupo de tratamiento solo (Fig. 4B). En general, la combinación HCQ y 2-DG induce ERS activando la vía PERK/eIF2α/ATF-4/CHOP en células 4T1 y células CMT-7364.

A Imágenes TEM representativas que representan la ultraestructura de las células 4T1 y CMT-7364 tratadas sin o con HCQ, 2-DG o 2-DG combinadas con HCQ durante 24 h. Las flechas rojas indican vacuolas autofágicas; Las flechas azules indican retículo endoplásmico. Barras de escala: 2 mm (Miniatura), 200 nm (Ampliar imagen). B Análisis de transferencia Western de Grp78, PERK, p-PERK, eIF2α, p-eIF2α, ATF-4 y CHOP en células tratadas con HCQ y 2-DG solos o en combinación durante 24 h. Se utilizó β-actina como control interno. Los datos se representan como media ± DE de tres experimentos independientes. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, ns = no significativo (p ≥ 0,05).

La HCQ puede aumentar el pH de los lisosomas, lo que conduce a la inhibición de la fusión de lisosomas y autofagosomas y bloquea el flujo autofágico [24, 25]. Como mostró el análisis TEM (Fig. 4A), la terapia combinada promovió significativamente un aumento en las vacuolas autofágicas. Luego, se utilizó el análisis de transferencia Western para detectar la expresión de los marcadores autofágicos Beclin-1, LC3B-I/II en células 4T1 y CMT-7364. Como se muestra en los resultados cuantificados (Fig. 5A, B), el grupo de cotratamiento aumentó drásticamente los niveles de Beclin-1 y la lipidación de LC3B, mientras que las imágenes de puntos fluorescentes de LC3B también confirmaron este resultado (Fig. 5C, D).

A, B Análisis de transferencia Western de Beclin-1 y LC3B-II en células 4T1 y CMT-7364 que se trataron sin o con HCQ, 2-DG o 2-DG combinados con HCQ durante 24 h. Se utilizó β-actina como control interno. Los datos se representan como media ± DE de tres experimentos independientes. **p < 0,01, ****p < 0,0001. C, D Tinción por inmunofluorescencia de LC3B-II en células 4T1 y CMT-7364, que se trataron con HCQ y 2-DG solos o en combinación durante 24 h. Barra de escala: 10 μm. n = 3 experimentos independientes realizados por triplicado para cada condición y al menos 30 células puntuadas.

Tumor de mama triple negativo (TNBC) es un término colectivo para los subtipos de tumores de mama que carecen del receptor de estrógeno y del receptor de progesterona y no sobreexpresan el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano [26]. En comparación con los tumores que expresan positivamente el receptor de estrógeno, el receptor de progesterona y el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano, el TNBC es más agresivo y tiene peores efectos de tratamiento y pronóstico [27]. CMT-7364 (origen canino) es un tipo de célula TNBC con características invasivas y de transferencia similares a las células MDA-MB-231 (origen humano) [28]. Para una mejor comparación, también estudiamos las células 4T1 (origen de ratón), que también tienen características similares a las del TNBC [29].

Se ha demostrado que el 2-DG, un inhibidor de la glucólisis, induce la apoptosis en células cancerosas al inhibir la glucólisis y la producción de energía y activar la vía ERS [13, 30, 31]. Sin embargo, sólo el tratamiento con dosis altas de 2-DG puede lograr buenos resultados para aplicaciones prácticas, lo que restringe hasta cierto punto la generalización de 2-DG. La HCQ puede provocar una elevación del pH en los lisosomas, lo que puede inhibir la fusión de autofagosomas y autolisosomas y la degradación de la carga en los autofagosomas [32]. Aquí, mostramos que el tratamiento combinado de 2-DG y HCQ conduce a un aumento de la apoptosis celular al inducir ERS e inhibir la autofagia (Fig. 6).

Los metabolitos de 2-DG interfieren con la glicosilación de proteínas ligada a N, lo que lleva a la acumulación de proteínas desplegadas o mal plegadas en el RE, seguida de ERS, apoptosis y autofagia citoprotectora. La HCQ provoca la desacidificación de los lisosomas, inhibe la fusión de autofagosomas y lisosomas para formar autolisados, lo que da como resultado la inhibición de la degradación de proteínas mal plegadas e induce aún más estrés en el retículo endoplásmico, lo que en última instancia conduce a un aumento de la apoptosis.

La proteína homóloga del factor de transcripción C/EBP (CHOP) está implicada en ERS, que puede regular la apoptosis a través de la familia de proteínas BCL-2 [33]. Bajo ERS persistente, CHOP puede inhibir la expresión de Bcl-2, Bcl-XL y Mcl-1, activar la expresión de BIM e inducir un aumento en BAX y BAK [34]. Esta regulación inicia la activación de caspasa-3 y PARP y conduce a la apoptosis [35]. En nuestra investigación, encontramos que HCQ y 2-DG inhibieron la actividad de las células CMT-7364 y ​​4T1 de una manera dependiente de la concentración y del tiempo, y el uso combinado de HCQ y 2-DG mejoró aún más el efecto inhibidor. (Figura 1). Se observaron resultados similares en la tasa de migración y apoptosis en células TNBC. La detección de proteínas apoptóticas también ilustra este punto (Fig. 2). En modelos de ratones con tumores de trasplante ortotópico, el efecto terapéutico de 100 mg/kg de 2-DG usado solo fue similar al de 50 mg/kg de 2-DG combinado con el grupo HCQ, los cuales redujeron el volumen y el peso del tumor hasta cierto punto ( Figura 3, Figura S2). Además, el grupo 2-DG combinado con HCQ presentó un efecto terapéutico más significativo que los otros grupos (Fig. 3, S2). Estos resultados juntos ilustraron que el cotratamiento con 2-DG y HCQ podría promover eficazmente la apoptosis al inhibir la autofagia para inhibir el crecimiento del tumor.

El RE es el orgánulo más importante en la función secretora de las células eucariotas y es responsable del almacenamiento de iones calcio, el metabolismo de lípidos y carbohidratos y el plegamiento de proteínas. Debido a las características especiales de crecimiento y al entorno de las células tumorales, muchos factores estimulantes, incluida la hipoxia, la falta de aminoácidos y el suministro insuficiente de glucosa, afectarán el procesamiento de proteínas en la sala de emergencias. ERS se refiere a un aumento de proteínas desplegadas o mal plegadas causado en el ER. Para mantener la homeostasis celular, las células inician múltiples vías básicas, incluida la UPR, la degradación relacionada con el retículo endoplásmico, la autofagia, etc. Si estos programas reguladores son suficientes para mantener la función celular determina si la célula debe restaurar un estado estable o activar la muerte celular. programa [36,37,38,39]. La vía de señalización UPR consta de tres ramas principales: ER quinasa tipo proteína quinasa R (PERK), enzima que requiere inositol 1 (IRE1) y factor de transcripción activador 6 (ATF6). Los estudios han señalado que al comienzo de la respuesta de la UPR, todas las ramas se activan rápidamente para la citoprotección. A medida que el ERS continúa, las señales IRE1 y ATF6 se regularán a la baja, creando un desequilibrio, mientras que la señal PERK continuará emitiéndose y guiando a la célula hacia su desaparición [40, 41]. Por lo tanto, la vía PERK fue el foco de este estudio, al igual que otros estudios [42, 43]. La caracterización microscópica de los orgánulos se observó mediante TEM. Los resultados del análisis estadístico de TEM se muestran en la Fig. S3. Descubrimos que el número de RE ensanchados aumentó significativamente en las células TNBC tratadas con HCQ. Sin embargo, después del tratamiento con 2-DG, el número, la densidad de electrones y la longitud de ER en las células aumentaron significativamente en comparación con NC. Curiosamente, ER fue significativamente más corto en el grupo de cotratamiento, pero su número y densidad de electrones se mantuvieron en un nivel alto. Nuestra hipótesis es que el RE, como fuente principal de la membrana plasmática intracelular, proporciona fuentes de membrana para las vesículas autofágicas formadas masivamente, acortando así la longitud de su propia membrana plasmática [44, 45]. Los resultados de WB mostraron que la HCQ combinada con 2-DG aumentó significativamente los niveles de ERS a través de la vía PERK-eIF2α-ATF-4-CHOP (Fig. 4).

Desde levaduras hasta mamíferos, la autofagia es un proceso evolutivamente conservado [46, 47]. Se ha encontrado un alto grado de autofagia en muchas células tumorales para mantener la supervivencia celular [48, 49]. La autofagia participa en la degradación de proteínas/orgánulos dañados en las células y los convierte en aminoácidos [50]. Estos hallazgos respaldan la importancia de la autofagia para mantener la homeostasis celular. TEM mostró un aumento en vesículas autofágicas en células TNBC después del tratamiento con 2-DG en comparación con NC. Estudios anteriores han demostrado que 2-DG induce la formación de autofagosomas para mejorar la autofagia [51]. En combinación con nuestro estudio, se especula que la 2-DG podría inducir una respuesta protectora de autofagia mediante la privación de glucosa [52,53,54,55]. Por lo tanto, el bloqueo de la autofagia protectora se ha convertido en objeto de muchos estudios [56,57,58]. En nuestro estudio se aplicó HCQ para bloquear la autofagia protectora. En las células TNBC tratadas con una combinación de 2-DG y HCQ, el número de vesículas autofágicas y los niveles de proteína de Beclin-1 y LC3B-II aumentaron significativamente que los tratados con los grupos de un solo fármaco (Figs. 4 y 5). Se indica que HCQ puso fin a la autofagia protectora inducida por 2-DG.

En este estudio, demostramos el efecto antitumoral eficaz de la combinación de 2-DG y HCQ en células TNBC tanto in vivo como in vitro. De hecho, la notable eficacia de su combinación para afectar la viabilidad celular mediante la inhibición de la autofagia y la ERS continua puede tener implicaciones importantes en el tratamiento del cáncer de mama.

Las células 4T1 utilizadas en este estudio se obtuvieron del Banco de Células de la Academia China de Ciencias (Shanghai, China), y las células CMT-7364, una línea celular aislada de tumor de mama canino, fueron proporcionadas amablemente por el Laboratorio Degui Lin del Centro Agrícola de China. Universidad [59]. Todas las líneas celulares se cultivaron en medio RPMI 1640 con 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina-estreptomicina a 37 °C con 5% de CO2. Las células se cultivaron en matraces de cultivo de células T25. Cuando la densidad celular alcanzó más del 80%, las células se subcultivaron en placas de 96 pocillos o en placas de 6 pocillos para los experimentos correspondientes.

La transferencia Western y la inmunofluorescencia se realizaron utilizando los siguientes anticuerpos: fosfo‐PERK (p-PERK), fosfo‐eIF2α (p-eIF2α), caspasa-3 escindida (c-Casp3), β‐actina (Cell Signaling Technologies; Danvers, MAMÁ); PARP escindido (c-PARP), CHOP, Bax, Bcl-2, Grp78, PERK, eIF2α, ATF-4, Beclin-1, LC3B-I/II (Abcam, Cambridge, Reino Unido). 2‐DG (pureza ≥98%) y HCQ (pureza >99%) se obtuvieron de Sigma‐Aldrich Chemical (Agente de Shanghai, China). El kit de ensayo de apoptosis y el kit de detección de apoptosis con anexina V FITC con PI (yoduro de propidio) se adquirieron en el Instituto de Biotecnología Beyotime (Shanghai, China). Se adquirió el Cell Counting Kit‐8 para la detección de la viabilidad celular (CCK‐8, Dojindo Laboratories, Minato‐ku, Tokio, Japón). Todos los demás productos químicos y reactivos eran de la más alta disponibilidad comercial.

Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 2 x 104 células/ml (37 °C, 12 h). Hubo cinco repeticiones para un grupo y diferentes concentraciones de 2-DG (0,25, 0,5, 1, 2 o 4 mM) combinadas con o sin HCQ (10 μM) y HCQ (5, 10, 20, 40, 80, 120 , 160, 200 o 400 μM) y se incubaron durante otras 24 h. En el otro conjunto de experimentos, las células se cultivaron con PBS, HCQ (10 μM), 2-DG (1 mM) o 2-DG (1 mM) combinados con HCQ (10 μM) durante diferentes tiempos (12, 24, 48 o 72h). El medio de cultivo con la misma concentración de fármacos se cambió cada 12 h a menos que se indique lo contrario. Después del tratamiento, se añadió un total de 10 µl (5 mg/ml) de CCK-8 por pocillo y se incubó a 37 °C durante 1 h. La viabilidad celular se midió mediante absorbancia (densidad óptica) con un lector de microplacas (Bio‐Rad Instruments, Hercules, CA) a 450 nm.

La migración celular se evaluó mediante ensayos de raspado de cicatrización de heridas como se describió anteriormente. Se sembraron células CMT-7364 y ​​células 4T1 en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos. Cuando las células crecieron hasta una confluencia del 80%, se hicieron rasguños utilizando puntas de pipeta de plástico de 200 μl y las células se lavaron cuidadosamente dos veces con PBS. Luego, las células se estimularon con medio sérico reducido Opti-MEM (Invitrogen, CA) que contenía PBS, HCQ, 2-DG o 2-DG combinado con HCQ durante 24 h. Las imágenes fueron tomadas desde un microscopio invertido conectado a una cámara Canon. Se utilizó el software ImageJ para medir la distancia de separación de la herida.

Los ensayos de apoptosis se realizaron utilizando tinción doble con anexina V-FITC (isotiocianato de fluoresceína) y yoduro de propidio (PI). Se cultivaron células CMT-7364 y ​​células 4T1 en placas de 6 pocillos durante 12 h. Una vez alcanzado el tratamiento predeterminado, las células se lavaron dos veces con PBS preenfriado. Las células se digirieron con tripsina y se centrifugaron a una velocidad de 1000 rpm/min durante 5 minutos, se lavaron dos veces con PBS preenfriado y se resuspendieron en tampón de unión (500 μl) a una concentración de 1 x 106 células/ml. Las células se agitaron suavemente y se incubaron con 5 μl de anexina V-FITC y 10 μl de yoduro de propidio a temperatura ambiente durante 10 minutos en la oscuridad según las instrucciones del fabricante. Las tasas de apoptosis se determinaron mediante citometría de flujo (Becton Dickinson; Franklin Lakes, Nueva Jersey) y se analizaron mediante el software FlowJo 10.6.2.

Se cultivaron células CMT-7364 y ​​células 4T1 en placas de 6 pocillos. Después del tratamiento, las células se fijaron (4 °C, durante la noche) usando paraformaldehído al 2,0% (v/v) y glutaraldehído al 2,5% (v/v) en PBS 0,1 M. Las células se lavaron en PBS, se fijaron en tetróxido de osmio al 1% a temperatura ambiente (20 °C) durante 2 h y luego se lavaron tres veces en PBS. Después de eso, las células se deshidrataron en una serie graduada de acetona (30%, 50%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% (v/v) de etanol). El último paso se repitió dos veces durante 20 min cada vez. Las muestras se permeabilizaron en una mezcla 2:1 de acetona y Epon durante la noche a 37 °C, luego se colocaron en acetona en Epon (mezcla 1:1) durante 8 h a 37 °C y finalmente en Epon puro durante la noche a 37 °C. Luego, las células se transfirieron a un molde de fundición para su polimerización a 60 °C. Las muestras se cortaron con un espesor de 80 μm (Leica, Wetzlar, Alemania). Las secciones se colocaron en una rejilla de cobre y se tiñeron con acetato de uranio al 2% y citrato de plomo. Luego, las secciones se secaron durante la noche a temperatura ambiente y se examinaron utilizando un microscopio electrónico de transmisión (Hitachi, Tokio, Japón).

El análisis de transferencia Western (WB) se llevó a cabo según métodos anteriores y se describe brevemente a continuación. La proteína total de las células se recogió con una solución de lisis RIPA que involucra PMSF e inhibidores de fosfatasa (BioSharp, Hefei, China). Las proteínas de la muestra se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF. La membrana se bloqueó durante 2 h en leche desnatada al 5%, seguido del tratamiento con anticuerpo primario y anticuerpo secundario. Las proteínas se visualizaron con un sistema de imágenes ChemiDoc MP (Bio-Rad, EE. UU.) y la expresión de proteínas se analizó con el software ImageJ.

La tinción por inmunofluorescencia (IF) se llevó a cabo según métodos anteriores y se describió brevemente a continuación. Las células CMT-7364 y ​​las células 4T1 se cultivaron en placas de 24 pocillos a una densidad de 1 x 105 células/ml. Después del tratamiento, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% (v/v) durante 30 minutos y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5% en PBS durante 20 minutos. Posteriormente, las células se bloquearon con BSA al 5% durante 2 h y se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C. Se usó IgG anti-conejo de cabra marcada con FITC o Cy3 (H + L) para incubar las células en la oscuridad durante 1 h y teñirlas con 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Beyotime, China) para detección nuclear. contratinción durante 2 min. En este experimento, las células se lavaron tres veces con PBS entre cada tratamiento. Las imágenes se observaron bajo un microscopio de fluorescencia (Olympus, Tokio, Japón).

Se compraron ratones hembra BALB/c (16–18 g) de seis semanas de edad en el Centro Experimental de Animales de la Universidad Agrícola de Huazhong de la provincia de Hubei (Wuhan, China) una semana antes de los experimentos. Los animales de experimentación fueron cuidados y utilizados bajo las pautas del Comité Ético Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Agrícola de Huazhong y los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos. Se recogieron aproximadamente 5 × 107 células 4T1 y se suspendieron en 2,5 ml de PBS y luego se inyectaron por vía subcutánea en la cuarta almohadilla mamaria de los ratones. Los ratones desarrollaron bultos evidentes dos semanas después de la inyección. Estos ratones fueron distribuidos aleatoriamente en cinco grupos y a todos se les inyectaron por vía intraperitoneal diferentes fármacos. Los ratones del primer grupo fueron tratados con HCQ (50 mg/kg, en días alternos durante 25 días). Los ratones del segundo grupo fueron tratados con 2-DG (100 mg/kg, en días alternos durante 25 días). Los ratones del tercer grupo fueron tratados con 1/2 2-DG (50 mg/kg, en días alternos durante 25 días) y HCQ (50 mg/kg, en días alternos durante 25 días) al mismo tiempo. Los ratones del cuarto grupo fueron tratados con 2-DG (100 mg/kg, en días alternos durante 25 días) y HCQ (50 mg/kg, en días alternos durante 25 días) al mismo tiempo. El último grupo fue tratado con PBS como grupo de control. El volumen del tumor y el peso corporal se midieron cada 2 días. Volumen del tumor (V) = 0,5 × largo × ancho2. Finalmente, los ratones fueron sacrificados humanamente al final del experimento, se recolectaron y pesaron los tumores, y los principales órganos vitales, como el hígado, los pulmones, el bazo, el corazón y los riñones, de cada grupo se recolectaron y fijaron en paraformaldehído al 4%.

Posteriormente, los tumores y órganos se deshidrataron y se incluyeron en parafina 48 h después de la fijación en formaldehído y luego se cortaron en rodajas de 5 µm de espesor para la tinción con hematoxilina y eosina (H&E). Se utilizó un microscopio óptico (Olympus, Japón) para la recolección de imágenes. Las secciones del tumor también se aplicaron para tinción por inmunofluorescencia.

Las secciones del tumor también se aplicaron para tinción por inmunofluorescencia. Después de desparafinarlas con xileno y un gradiente de etanol en agua, las secciones del tumor se sumergieron en un tampón de reparación del antígeno de ácido cítrico (pH 6,0) y se calentaron en un horno de microondas para la reparación del antígeno. Luego, las secciones de tumores se sometieron a un procedimiento similar al paso 2.8, incluido el bloqueo con suero de cabra, la incubación con anticuerpos primarios y secundarios, la contratinción con DAPI y el sellado con tabletas de sellado antifluorescencia. Las imágenes se observaron bajo un microscopio de fluorescencia (Olympus, Tokio, Japón).

Los datos se presentan como medias ± desviación estándar (medias ± DE) de al menos tres experimentos independientes. Las diferencias entre grupos se calcularon mediante análisis de varianza de dos vías o prueba t de Student no apareada (GraphPad Prism 8). Un nivel de *p < 0,05 se consideró significativo y **p < 0,01, ***p < 0,001 o ****p < 0,0001 se consideró extremadamente significativo. Un nivel de p > 0,05 (ns) se consideró no significativo.

Todos los datos están disponibles en el texto principal o en los materiales complementarios.

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Los autores agradecen al Prof. Degui Lin (Universidad Agrícola de China, Beijing, China) por proporcionar la línea celular CMT-7364.

Proyecto apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención No. 32172925).

Estos autores contribuyeron igualmente: Ning Zhou, Qingyun Liu.

Departamento de Medicina Veterinaria Clínica, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Agrícola de Huazhong, Wuhan, Hubei, 430070, China

Ning Zhou, Xiao Wang, Lixin He, Han Zhou, Xinying Zhu, Tianhong Zhou, Ganzhen Deng y Changwei Qiu

Laboratorio Estatal Clave de Microbiología Agrícola, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Agrícola de Huazhong, Wuhan, Hubei, 430070, China

Qingyun Liu

Departamento de Medicina Veterinaria Clínica, Facultad de Ciencia y Tecnología Animal, Universidad Agrícola de Anhui, Hefei, 230036, China

Tao Zhang

Departamento de Ciencia y Tecnología Animal, Escuela Profesional de Agricultura y Silvicultura de Shanghai, Shanghai, 201699, China

Xinying Zhu

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Conceptualización: NZ y QL; metodología: NZ, QL y XW; administración de proyectos: NZ, QL, LH, TZ (Tao Zhang), HZ, XZ y TZ (Tianhong Zhou); redacción: borrador original: NZ, QL y XW; redacción: revisión y edición: NZ, QL, GD y CQ. Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Correspondencia a Changwei Qiu.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Zhou, N., Liu, Q., Wang, X. et al. La combinación de hidroxicloroquina y 2-desoxiglucosa mejora la apoptosis en las células de cáncer de mama al bloquear la autofagia protectora y mantener el estrés del retículo endoplásmico. Descubrimiento de muerte celular. 8, 286 (2022). https://doi.org/10.1038/s41420-022-01074-6

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Recibido: 05 de marzo de 2022

Revisado: 12 de mayo de 2022

Aceptado: 27 de mayo de 2022

Publicado: 11 de junio de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41420-022-01074-6

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Ciencias de la vida celulares y moleculares (2022)