integrina

Jul 19, 2023

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 680 (2023) Citar este artículo

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Los axones de las células ganglionares de la retina (CGR) convergen en el disco óptico para formar un nervio óptico. Sin embargo, el mecanismo de convergencia de los axones de RGC sigue siendo difícil de alcanzar. En la retina embrionaria existe un campo eléctrico (FE) y este FE converge en el futuro disco óptico. Se ha demostrado in vitro que las FE orientan los axones hacia el cátodo. Aquí, muestro que el EF dirige los axones de RGC a través de la integrina de una manera extracelular dependiente de Ca2+. El crecimiento catódico de los axones de RGC de pollo embrionario, que expresan la integrina α6β1, fue potenciado por anticuerpos monoclonales anti-integrina β1 de pollo. Mn2+ abolió estos efectos de EF, ya que Mn2+ ocupa el sitio regulador negativo dependiente de Ca2+ en la subunidad β1 para eliminar la inhibición de Ca2+. El presente estudio propone un modelo de dirección eléctrica de axones mediado por integrinas, que implica movimientos direccionales de Ca2+ y estabilización asimétrica de microtúbulos. Dado que las células neuroepiteliales generan FE durante la neurogénesis, la guía de los axones eléctricos puede usarse principalmente en el desarrollo del sistema nervioso central.

Durante el desarrollo del sistema nervioso central (SNC), incluida la retina, las neuronas primogénitas extienden axones que viajan largas distancias, como los axones comisurales y los nervios ópticos, aunque se desconoce la señal de guía para estos primeros axones largos. Actualmente, la creencia predominante es que los conos de crecimiento detectan gradientes de concentración de quimioatrayentes de largo alcance. Sin embargo, es poco probable que los gradientes por sí solos proporcionen una señal direccional con alta fidelidad debido a los límites físicos fundamentales de la detección de gradientes1. De hecho, inicialmente se propuso que la netrina fuera un quimioatrayente difusible de largo alcance para los axones comisurales, pero estudios posteriores revelaron que actúa localmente promoviendo la adhesión de los conos de crecimiento en el cerebro y la médula espinal2, o como una señal de corto alcance en el disco óptico3. .

Los axones en crecimiento están dirigidos no sólo por señales químicas sino también por campos eléctricos (EF) en un proceso llamado galvanotropismo4. La primera evidencia experimental de este fenómeno se presentó hace más de un siglo, en 19205, tras la invención de la técnica del cultivo de tejidos6. Sin embargo, la relevancia fisiológica de la guía eléctrica de los axones sigue siendo controvertida por dos razones: (1) porque la evidencia in vivo de su importancia ha sido escasa y (2) porque los mecanismos moleculares son algo confusos.

La retina es un modelo adecuado para estudiar el desarrollo del SNC. En la retina embrionaria del pollo existe un gradiente de voltaje extracelular, que se genera por el transporte de sodio de las células neuroepiteliales7,8. Este EF converge en el futuro disco óptico y es esencial para la correcta orientación de los axones del RGC7. Por lo tanto, se planteó la posibilidad de que el EF actúe como una señal de guía para los axones de RGC. Esta posibilidad se examinó en el presente estudio utilizando la retina embrionaria de pollo. También se estudiaron los mecanismos moleculares basándose en las siguientes consideraciones.

Una FE provoca movimientos direccionales de iones en el espacio extracelular. Estos movimientos iónicos pueden ser una señal direccional, porque los iones movidos por EF encuentran las moléculas de la superficie celular de manera diferente en los lados anódico y catódico de un axón. Los iones en movimiento pueden regular asimétricamente la molécula de la superficie celular que desencadena la dirección del axón. Como molécula candidata para esta función, se consideró la integrina por las siguientes razones: (1) los axones de las RGC de embriones de pollo expresan la integrina α6β19, (2) la afinidad de la integrina por el ligando de la matriz extracelular (MEC) está regulada dinámicamente por el Ca2+ extracelular en el rango de concentración fisiológica10,11, (3) la pérdida de integrina da como resultado la desorganización de los axones de las CGR12, (4) la integrina media la migración celular direccional inducida por EF13,14,15,16, y (5) una reducción del Ca2+ extracelular actúa como una señal de orientación para la migración celular mediada por integrinas durante la cicatrización de heridas17. El presente estudio demuestra que el EF orienta los axones de RGC a través de la integrina y propone un modelo de dirección de axones dependiente de Ca2+. Se discute el papel de las FE en el desarrollo del SNC.

Se explantaron tiras de retina de pollitos embrionarios del día 6 (E6) del segmento que originalmente era dorsal a la cabeza del nervio óptico (Fig. 1a, b). Se incluyeron en Matrigel® porque Matrigel® y la capa de fibra óptica contienen el ligando de la ECM para la integrina18,19. Dado que la orientación de los axones de RGC que crecen desde la tira de retina refleja el patrón de crecimiento de los axones durante el desarrollo normal in vivo20, numerosos axones emergieron del lado ventral de las tiras de retina, como lo muestran las imágenes de fluorescencia de axones vivos (Fig. 1c, e ). Era probable que los axones que ya habían sido orientados antes del explante se extendieran ventralmente20,21. Los axones de las CGR aparecieron preferentemente en la parte central de las tiras de la retina, donde la densidad de las CGR es alta22. La extensión ventral se cuantificó a partir de la intensidad de fluorescencia (tasa de extensión ventral, VER, Fig. 1c, d).

a Se explantó una tira de retina desde el segmento dorsal hasta la cabeza del nervio óptico de la retina de un pollo embrionario del día 6 (E6). b La tira de retina se fijó con un filtro de membrana en forma de cuña insertado entre el borde nasal oblicuo de la tira de retina y la pared de la cámara de cultivo. El borde temporal hace contacto con la pared opuesta. c Una tira de retina incubada durante 24 h sin FE. Las células vivas y los axones de RGC se marcaron con fluorescencia con calceína-AM. Los axones de RGC se extendían desde el borde ventral de la franja retiniana. Las líneas horizontales indican la distancia desde el borde ventral. d La intensidad de fluorescencia media medida en las líneas de (c) se representó frente a la distancia desde el borde ventral. La tasa de extensión ventral (VER) es la relación entre la intensidad de fluorescencia media entre las líneas ventrales de 150 μm y 400 μm con respecto a la tira retiniana indicada por el rectángulo en (c) frente a la intensidad de fondo medida en el área sin retina indicada por el cuadrado. en la esquina superior derecha en (c). e Los axones de RGC se extienden desde el borde ventral en la parte central de la tira de retina en (c). f axones de RGC cultivados en el EF dirigido ventralmente (flecha hacia abajo). g de axones de RGC cultivados con EF y TASC (100 μg/ml). h Axones de RGC cultivados con EF y W1B10 (100 μg/mL). i Axones de RGC cultivados con EF y el anticuerpo de control IgG1 (200 μg/ml). j Axones de RGC cultivados en el EF dirigido dorsalmente (flecha hacia arriba). k VER (media ± sem) de tiras de retina cultivadas (desde la izquierda), sin EF (no, n = 24 fotografías tomadas en diferentes niveles de enfoque de 4 tiras de retina); con la FE dirigida ventralmente (flecha hacia abajo, n = 18 de 3 tiras de retina); con EF y TASC (100 μg/mL, n = 18 de 3 tiras de retina); con EF y W1B10 (100 μg/mL, n = 18 de 3 tiras de retina); con EF y el anticuerpo control (200 μg/mL, n = 18 de 3 tiras de retina); con el EF dirigido dorsalmente (flecha hacia arriba, n = 24 de 4 tiras de retina). Las barras horizontales y los asteriscos indican diferencias significativas (prueba t de dos colas, **P < 0,001). l Relaciones dosis-respuesta entre la concentración de anticuerpos (TASC, W1B10) y VER (media ± sem) de tiras de retina cultivadas en la FE dirigida ventralmente (n = 18 de 3 tiras de retina para cada punto). Los VER a 0 y 100 μg/ml se volvieron a representar desde (k). m Una tira de retina cultivada en el EF dirigido dorsalmente. Se elevó la intensidad del fondo para visualizar los axones en el lado dorsal. Los axones del lado ventral se muestran en (j) en un nivel de fondo normal.

Los axones en crecimiento son dirigidos por EF hacia el cátodo4,21,23,24. La extensión ventral aumentó en el EF dirigido ventralmente, cuya fuerza se mantuvo en 15 mV / mm para imitar el EF7 in vivo (Fig. 1f, k). Por el contrario, disminuyó en la EF dirigida dorsalmente (Fig. 1j, k), lo que se conoce como supresión anódica23. Estos resultados pueden implicar que la FE dirigió los axones de las RGC recién nacidas o los axones no orientados hacia el cátodo y también podría reorientar los axones en crecimiento ventral. Los axones dorsales parecieron aumentar en la FE inversa, aunque no se analizaron porque fue necesario aumentar la intensidad de fondo para visualizarlos (Fig. 1m).

Para examinar si la integrina estaba involucrada en el efecto eléctrico, se preincubaron tiras de retina en un medio de cultivo que contenía el anticuerpo monoclonal anti-integrina β1 de pollo TASC25 y luego se incluyeron en Matrigel® que contenía TASC. La extensión ventral hacia el cátodo se mejoró de manera dependiente de la dosis (Fig. 1g, k, l). Otro anticuerpo monoclonal anti-integrina β1 de pollo, W1B1026, también mejoró el crecimiento catódico de manera más efectiva que TASC en concentraciones bajas (≤50 μg/mL, Fig. 1h, k, l). El anticuerpo de isotipo de control negativo IgG1 de ratón no mejoró el crecimiento catódico incluso a una concentración alta (200 μg / ml, Fig. 1i, k). TASC y W1B10 también aumentaron la extensión ventral sin EF (Figuras complementarias 1b-d), mientras que el anticuerpo de isotipo de control negativo IgG1 de ratón no aumentó la extensión ventral sin EF (Figuras complementarias 1a, d). A pesar de que TASC y W1B10 aumentaron la extensión basal, los aumentos en VER con EF en comparación con sin EF [(VERs con EF) − (VER medio sin EF), índice de EF, EFI] fueron mayores que el control sin los anticuerpos ( Figura complementaria 1e). Por lo tanto, la integrina medió los efectos de las FE, pero persistía la posibilidad de que la integrina pudiera haber regulado la extensión del axón sin estar involucrada en la orientación del axón. Para examinar si la integrina participa en la orientación eléctrica de los axones, en las siguientes secciones se investigó el papel del Ca2+ en la regulación de las integrinas.

El dominio de unión al ligando de la subunidad β1 de la integrina contiene el sitio regulador negativo dependiente de Ca2+ denominado ADMIDAS11. La unión de Ca2+ a ADMIDAS cambia la integrina a una conformación cerrada para inhibir la unión del ligando11. A medida que el EF mueve el Ca2+ en la ECM gelatinosa, es posible que el Ca2+ movido direccionalmente regule la integrina de forma asimétrica en la superficie del axón. Para examinar esta posibilidad, se añadió Mn2+ al medio de preincubación, Matrigel®, y al medio de cultivo porque Mn2+ ocupa ADMIDAS y estabiliza la integrina en la conformación abierta para mantener una alta afinidad integrina-ligando11. Mn2+ a 500 μM eliminó el efecto eléctrico incluso en presencia de TASC o W1B10 (Fig. 2a-g, Fig. complementaria 2a).

axones de RGC cultivados con Mn2+ 500 μM. b Axones de RGC cultivados con Mn2+ 500 μM en el EF dirigido ventralmente. c Axones de RGC cultivados con Mn2+ 500 μM y TASC (100 μg/mL). d Axones de RGC cultivados con Mn2+ 500 μM y TASC (100 μg/mL) en el EF dirigido ventralmente. e Axones de RGC cultivados con Mn2+ 500 μM y W1B10 (100 μg/mL). f Axones de RGC cultivados con Mn2+ 500 μM y W1B10 (100 μg/mL) en el EF dirigido ventralmente. g VER (media ± sem) de tiras de retina cultivadas con Mn2+ 500 μM (desde la izquierda), sin EF (no); con el EF (EF) dirigido ventralmente; sin EF y con TASC (no/TA); con EF y TASC (EF/TA); sin EF y con W1B10 (no/WB); con EF y W1B10 (EF/WB). Cada columna representa el valor obtenido de 18 fotografías tomadas en diferentes niveles de enfoque a partir de 3 tiras de retina. Las barras horizontales y los asteriscos indican diferencias significativas (prueba t de dos colas, **P < 0,001). h, i Una retina E4 completa cultivada sin Mn2+ durante 24 h (un día in vitro, 1 DIV). h Axones RGC en la región central dorsal a la cabeza del nervio óptico. i Axones RGC en la región dorso-nasal que se extienden hasta la cabeza del nervio óptico (abajo a la izquierda). j, k Una retina E4 completa cultivada con Mn2+ 500 μM durante 24 h. j Axones RGC en la región central dorsal a la cabeza del nervio óptico. k Los axones de RGC en la región dorso-nasal se extienden aleatoriamente. Las puntas de flecha amarillas señalan trayectorias axónicas anormales. l, m Una tira de retina cultivada en una FE enfocada. l El lado ventral de la tira de retina mira hacia el lado abierto de un chip de microfluidos en forma de abanico con el canal central, a través del cual fluye una corriente de 56 μA hacia el cátodo. Los axones que crecieron convergieron en el canal y entraron en él. m Una imagen de gran aumento de los axones convergentes en (l). n, o Una tira de retina cultivada con Mn2+ 500 μM en el mismo EF enfocado. n El lado ventral de la tira retiniana. o Una imagen de gran aumento de (n). La fuerza de EF al aplicar 56 μA se estimó en 9 mV/mm alrededor de la tira de retina y en la entrada del canal fue de 300 mV/mm (ver "Métodos").

Cuando la concentración de Mn2+ se elevó a 1,0 mM (once retinas analizadas) y 1,5 mM (cinco retinas analizadas), se suprimió el crecimiento ventral (Figura complementaria 2b). En cambio, se encontraron arborizaciones locales dentro de la tira de retina (Figura complementaria 2c). Estos resultados de Mn2+ elevado pueden implicar que la extensión del axón requiere la disociación de la integrina del ligando (que se analiza más adelante).

Para examinar si la regulación de Ca2+ de la integrina subyace a la orientación correcta de los axones de RGC in vivo, se aplicó Mn2+ al cultivo organotípico de toda la retina neural de polluelos E4. En las retinas de control incubadas durante 24 h sin Mn2+, los axones de RGC se orientaron correctamente en la región central cerca de la cabeza del nervio óptico y fuera de la región central27 (Fig. 2h, i, cuatro retinas analizadas). En el medio de cultivo que contenía Mn2+ 500 μM, los axones cercanos a la cabeza del nervio óptico se orientaron correctamente (Fig. 2j), mientras que se encontraron extensiones caóticas fuera de la región central (Fig. 2k, puntas de flecha amarillas, siete retinas analizadas). Estas trayectorias anormales podrían haberse debido a un efecto nocivo del Mn2+. Sin embargo, el hecho de que los axones de las RGC normalmente se hubieran extendido en la región central podría excluir tal efecto. Dado que los axones de las RGC se desarrollan por primera vez en la región central27, los axones cerca de la cabeza del nervio óptico parecían ya haber sido orientados correctamente antes de la adición de Mn2+. Por lo tanto, la unión de Ca2+ a ADMIDAS se consideró esencial para la correcta orientación de los axones de RGC in vivo. Los mismos resultados se observaron en el estudio anterior7, donde se suprimió la FE endógena aplicando amilorida al cultivo organotípico para bloquear los canales de sodio epiteliales de las células neuroepiteliales8. A partir de los resultados anteriores y actuales, parecía probable que el EF endógeno dirigiera los axones de RGC a través de la integrina de una manera extracelular dependiente de Ca2+.

Suponiendo que el EF endógeno dirige los axones de las RGC a la cabeza del nervio óptico, el tallo de un nervio óptico podría reproducirse in vitro enfocando el EF. Para probar esta idea, se colocó una tira de retina frente a un chip de microfluidos en forma de abanico (Figura complementaria 3), cuyo canal central (0,2 mm de ancho) permitía que la corriente fluyera hacia el cátodo. En el EF enfocado, los axones de RGC convergieron y entraron en el canal (cinco retinas probadas a 56 μA, Fig. 2l, m; dos retinas probadas a 6.0 μA y 0.6 μA, respectivamente, Fig. Suplementaria 4a-d). Incluso sin la corriente exógena, los axones de RGC se reunieron y entraron en el canal conectando el canal al medio de cultivo de exceso de volumen, como una conexión a tierra eléctrica (dos retinas probadas, Figura complementaria 4e, f). Este hecho podría explicarse por el transporte activo de iones del propio neuroepitelio de la retina (ver Discusión). Cuando la salida del canal se bloqueó con un tapón de goma para evitar flujos iónicos, los axones de RGC no convergieron (se probaron tres retinas, figura complementaria 4g, h). Mn2+ también abolió la convergencia de los axones (tres retinas probadas a 56 μA, Fig. 2n, o). Estos resultados apoyan firmemente la idea de que los axones de las RGC están dirigidos eléctricamente al futuro disco óptico7.

Para cuantificar la convergencia de los axones de RGC en EF enfocados, se diseñó una cámara de microcanales (Figura complementaria 5). En el EF enfocado al aplicar una corriente de 120 μA, los axones de RGC convergieron en el microcanal (Fig. 3a). El ángulo de convergencia (CA) se midió en los axones que se habían extendido directamente desde las regiones nasal y temporal hacia el microcanal (Fig. 6a complementaria, Fig. 3d). Las intensidades de fluorescencia dentro de CA se midieron en la línea de media distancia entre la retina y el microcanal (Figuras complementarias 6a, d). La suma total de estas intensidades de fluorescencia se calculó como otro parámetro de convergencia de axones (FCA, Fig. 3e). Además, el FCA se dividió por el número de píxeles de la línea de media distancia para obtener la intensidad de fluorescencia media en un píxel como índice de densidad de axones (FCA medio, Fig. 3f). Para determinar si la convergencia del axón RGC mediada por integrinas, se probaron W1B10 y Mn2+. W1B10 (100 μg/mL) aumentó CA, FCA y FCA media (Fig. 3b, d – f, Fig. complementaria 6b, e), mientras que Mn2+ a 100 μM los disminuyó (Fig. 3c, d – f, Fig. complementaria .6c, f). Sin aplicar corrientes, los axones de RGC se extendieron sin convergencia (tres retinas probadas, figura complementaria 6g). Mn2+ a 500 μM eliminó completamente la convergencia de los axones (tres retinas analizadas, figura complementaria 6h). Estos resultados sugirieron que la integrina mediaba la orientación eléctrica de los axones de RGC y su convergencia en la FE enfocada.

axones a – c RGC que se extienden desde el borde ventral de tiras de retina cultivadas en un EF enfocado aplicando una corriente de 120 μA. axones de RGC cultivados sin fármaco. b Axones de RGC cultivados con W1B10 (100 μg/ml). c Axones de RGC cultivados con Mn2+ 100 μM. d Ángulo de convergencia (CA, media ± sem) de axones de RGC cultivados en el EF enfocado sin fármaco (cont.), con W1B10 (WB) y Mn2+ 100 μM (Mn2+). CA es el ángulo entre los axones que se extienden directamente desde las regiones nasal y temporal de la tira retiniana (líneas amarillas en las figuras complementarias 6a-c). Cada columna representa el valor obtenido de 18 fotografías tomadas en diferentes niveles de enfoque a partir de 3 tiras de retina. e Total de las intensidades de fluorescencia dentro de CA (FCA, media ± sem). Las intensidades de fluorescencia se midieron en la línea de media distancia entre la retina y el microcanal (líneas cian en las figuras complementarias 6a-c). Su suma total se calculó a partir de los perfiles transversales (Figuras complementarias 6d-f). Los datos se obtuvieron de las fotografías utilizadas en (d). f Intensidades medias de fluorescencia dentro de CA (FCA media, media ± sem). FCA se dividió por el número de píxeles de la línea de media distancia. Las barras horizontales y los asteriscos indican diferencias significativas (prueba t de dos colas, *P < 0,01, **P < 0,001). La fuerza de EF al aplicar 120 μA se estimó en 20 mV/mm alrededor de la tira de retina y en la entrada del microcanal fue de 300 mV/mm (ver "Métodos").

Para revelar la dinámica del Ca2+ alrededor de un axón en un EF, se tomaron imágenes de los movimientos del Ca2+ en los lados anódico y catódico de un axón. Para este propósito, se utilizó un tinte fluorescente aniónico sensible a Ca2+ (CalbryteTM-520L, Kd: 90 μM) en el cultivo disociado de capa fina basado en Matrigel®. Se identificó un solo axón en el sistema de microscopio confocal de gran aumento con luz transmitida (Figura complementaria 7). La fluorescencia se midió en los axones que eran perpendiculares a la dirección de EF, ya que se suponía que la superficie del axón actuaría como una pantalla para el Ca2+ movido por EF. No se seleccionaron conos de crecimiento para esta medición porque sus finas protuberancias no se identificaron con luz transmitida. Para evitar la saturación de la fluorescencia sensible a Ca2+, la capa delgada de Matrigel® se lavó con una solución libre de Ca2+. Se colocó una micropipeta que contenía CaCl2 1 mM y CalbryteTM-520L 10 mM en el lado anódico del axón (Fig. 4a). Ca2+ se difundió fuera de la pipeta hacia el espacio extracelular con bajo contenido de Ca2+. Se entregó iontoforéticamente CalbryteTM-520L libre pasando una corriente constante (-200 nA) durante todo el experimento. Al identificar el axón mediante tinción negativa (Fig. 4b-d), se detuvo la EF y disminuyó la fluorescencia alrededor del axón. Luego, se aplicó una prueba de EF y la fluorescencia aumentó en ambos lados (Fig. 4e, f). Estos aumentos parecían deberse al Ca2+ movido por EF porque la fluorescencia disminuyó cuando se invirtió la dirección de la prueba EF (Figuras complementarias 8a, b, n = 5 axones). El valor integral del aumento en la intensidad de la fluorescencia durante la prueba directa EF fue mayor en el lado anódico que en el lado catódico; la media de las relaciones ánodo/cátodo fue 111,7 ± 1,0% (media ± sem, n = 12 axones de cuatro experimentos independientes, prueba t de dos colas, P <0,001, Fig. 4g). Estas relaciones excedieron la media de las relaciones ánodo/cátodo de las intensidades de fluorescencia antes de la aplicación de EF (106,4 ± 0,6%, media ± sem, n = 12, Fig. 4g, línea horizontal azul, cf. Fig. complementaria 8c). Estos resultados pueden sugerir que la superficie anódica de un axón encuentra Ca2+ movido por EF con más frecuencia que la superficie catódica en el movimiento direccional de Ca2+. El encuentro de Ca2+ sería más asimétrico en la ECM28 confinada in vivo.

a Una imagen de transmisión de un axón de RGC cultivado en cultivo disociado de capa fina basado en Matrigel®. Se colocó una micropipeta que contenía CaCl2 1 mM y CalbryteTM-520L 10 mM en el lado anódico del axón. b Una imagen ampliada del axón en (a). c Una imagen de tinción negativa del axón RGC en (b). CalbryteTM-520L difundido en el espacio extracelular. El patrón de rayas horizontales se debió a la rotación del disco de Nipkow en el escáner confocal. d El perfil transversal de una exploración lineal en la línea azul horizontal en (c) (azul) y el perfil transversal de toda la imagen de fluorescencia de (c) (negro) representada con intensidad de fluorescencia media/píxel. e, f Registros de fluorescencia de Ca2+ de los lados anódico (e) y catódico (f) del axón en (c). Los recuadros muestran cada área de grabación en verde claro en la misma escala que en (c). La intensidad de la fluorescencia se presenta con una profundidad de 64 bits. g Relación anódica/cátodo de valores integrales de aumentos en la intensidad de fluorescencia durante EF (intensidad de fluorescencia × tiempo) representada frente a los valores catódicos medidos en doce axones de RGC. La línea azul horizontal indica la relación ánoda/cátodo media de las intensidades de fluorescencia antes de la aplicación de EF (la línea vertical representa ± sem). Los axones medidos fueron perpendiculares a la dirección de EF (90,6° ± 1,6°, media ± sem, n = 12 de 4 experimentos).

Si el Ca2+ movido direccionalmente regula asimétricamente la integrina, se produciría una reorganización asimétrica del citoesqueleto, incluidos los filamentos de actina y los microtúbulos. En el presente estudio, los axones de RGC no se extendieron desde la tira retiniana en presencia de citocalasina D, un inhibidor de la polimerización de actina (dos retinas analizadas, figura complementaria 9). Sin embargo, los axones sin filopodios cultivados con citocalasina D pueden exhibir un comportamiento de orientación galvanotrópica, aunque crecen más lentamente29. Esto planteó la posibilidad de que la dirección eléctrica de los axones dependa, al menos en parte, de la dinámica de los microtúbulos.

Los microtúbulos toman dos estados en un axón en crecimiento: microtúbulos dinámicamente inestables y microtúbulos estables30,31,32. Los microtúbulos estables se transforman en microtúbulos inestables tras la fosforilación de MAP1B por GSK3β30. Dado que se ha demostrado que GSK3β y MAP1B tienen funciones funcionales en la dirección del cono de crecimiento33,34, se probó un inhibidor de GSK3β, LY2090314. LY2090314 a 2,5 nM mejoró la extensión ventral sin EF [Fig. 5a, yo, cf. Figura 1k (no), prueba t de dos colas, P <0,001]. No se observó ningún aumento adicional con EF (Fig. 5b, i). LY2090314 a 10 nM aún aumentó la extensión basal [Fig. 5c, yo, cf. Figura 1k (no), prueba t de dos colas, P <0,001] sin efecto de EF (Fig. 5d, i). Sin embargo, LY2090314 a 50 nM disminuyó la extensión basal [Fig. 5e, yo, cf. Figura 1k (no), prueba t de dos colas, P <0,001] sin efecto de EF (Fig. 5f, i). La mejora y supresión de la extensión ventral sin EF podría explicarse por dos funciones de los microtúbulos en la extensión del axón. Los microtúbulos dinámicos interactúan con la actina F en el borde de ataque para promover el avance del cono de crecimiento31. La alta dosis de LY2090314 habría provocado una falta de microtúbulos dinámicos. Por otro lado, la dosis baja de LY2090314 habría regulado positivamente la estabilización de los microtúbulos en crecimiento, preservando los microtúbulos dinámicos para el avance del cono de crecimiento. Los microtúbulos en crecimiento consisten en microtúbulos dinámicos inestables que se alargan desde el extremo positivo de un microtúbulo estable32. El MAP1B desfosforilado se une a estos microtúbulos en crecimiento para estabilizarlos31, lo que alarga el eje del axón. A continuación, se probó SC79, un activador de Akt, ya que Akt (PKB) inhibe GSK3β35 y se activa aguas abajo de la activación de la integrina mediante la activación de la fosfatidilinositol-3 quinasa (PI3K)18,36, cuya inhibición mejoró la extensión ventral sin EF y abolió los efectos EF (Figura complementaria 10). SC79 a 25 μM también mejoró la extensión ventral sin EF [Fig. 5g, yo cf. Figura 1k (no), prueba t de dos colas, P <0,001]. La EF no aumentó más la extensión ventral (Fig. 5h, i). La Figura 5j resume la falta de efectos EF en presencia de LY2090314 y SC79. La pérdida de efectos eléctricos puede sugerir que la inhibición de GSK3β es esencial para la dirección eléctrica de los axones.

axones de RGC cultivados con LY2090314 2,5 nM. b Axones de RGC cultivados con LY2090314 2,5 nM en el EF dirigido ventralmente. c Axones de RGC cultivados con LY2090314 10 nM. d Axones de RGC cultivados con LY2090314 10 nM en el EF dirigido ventralmente. e Axones de RGC cultivados con LY2090314 50 nM. f Axones de RGC cultivados con LY2090314 50 nM en el EF dirigido ventralmente. g de axones de RGC cultivados con SC79 25 μM. h Axones de RGC cultivados con SC79 25 μM en el EF dirigido ventralmente. i VER (media ± sem) de tiras de retina cultivadas con LY2090314 2,5 nM, 10 nM y 50 nM, y SC79 25 μM sin EF (no) y con EF dirigido ventralmente (EF). Cada columna representa el valor obtenido de 18 fotografías tomadas en diferentes niveles de enfoque a partir de 3 tiras de retina. Las barras horizontales y los asteriscos indican diferencias significativas (prueba t de dos colas, **P < 0,001). j EFI (media ± sem) sin fármaco (cont.) y con LY2090314 y SC79. El control se volvió a trazar a partir de la figura complementaria 1e (cont.). Los axones k, l, n, o RGC giran dorsalmente en la EF dirigida dorsalmente. Se extendían desde el borde ventral de las tiras de retina. El EF se aplicó durante 3 h antes de la tinción fluorescente. k Una imagen de transmisión de un axón RGC. l Una imagen de fluorescencia del axón en (k) teñida con TubulinaTrackerTM Green. m Perfiles transversales de la imagen de fluorescencia en (l) en el punto de giro (izquierda, negro) y la parte recta (derecha, azul). Los recuadros muestran cada línea de escaneo en amarillo con el índice de asimetría (AI, ver Figura complementaria 11a, b). Tamaño de un píxel: 14,4 × 14,4 nm. n Una imagen de transmisión de un axón RGC. o Una imagen de fluorescencia del axón en (n) teñida con faloidina fluorescente Acti-stainTM 488.

Suponiendo que la activación de la integrina conduce a la inhibición de GSK3β a través de la activación de Akt para estabilizar los microtúbulos, la integrina activada asimétricamente estabilizaría los microtúbulos de forma asimétrica. Por lo tanto, se examinó la distribución de los microtúbulos en los axones que giran hacia el cátodo mediante tinción con TubulinaTrackerTM Green (Fig. 5k, l). El índice de asimetría (AI, 1,00 significa simetría) se obtuvo de la imagen de fluorescencia (Fig. 5m, Fig. complementaria 11a, b). La IA indicó que los microtúbulos estaban situados asimétricamente más en el lado interno (es decir, catódico) en el punto de inflexión; la media de las IA fue 2,02 ± 0,17 (media ± sem, n = 6 axones de cinco experimentos independientes, prueba t de dos colas, P <0,01, figura complementaria 11a, c – g). Estos microtúbulos internos eran estables porque existían después de 30 minutos de tratamiento con nocodazol, dentro de los cuales desaparecieron los microtúbulos dinámicos32 (Figura complementaria 11g). La actina F no mostró una distribución tan unilateral (Fig. 5n, o).

La integrina y su ligando ECM son esenciales para la correcta guía de los axones de las RGC in vivo12. Sin embargo, aún se desconoce cómo la interacción integrina-ligando dirige el axón hacia el futuro disco óptico. Las adherencias basadas en integrinas sustentan la motilidad del cono de crecimiento37. Los contactos puntuales mediados por integrinas se distribuyen asimétricamente más hacia los lados para extenderse en un cono de crecimiento giratorio38,39. Las adherencias mediadas por integrinas subyacen a las protuberancias de los conos de crecimiento hacia una señal atractiva40. Las tasas de crecimiento de los axones se correlacionan con la formación de adherencias basadas en integrinas en respuesta a señales positivas y negativas41,42. Por tanto, la integrina es un actor crucial en la regulación del crecimiento y la dirección de los axones.

Los resultados de las mediciones de fluorescencia de Ca2+ sugirieron que la superficie anódica de un axón encuentra Ca2+ movido por EF con más frecuencia que la superficie catódica en al menos un 10%. Dado que la cabecera de integrina que contiene ADMIDAS ocupa ~1 zL (10-21 L)43 y la densidad de Ca2+ es ~0,6/zL en Ca2+ 1 mM, el Ca2+ movido direccionalmente se uniría a ADMIDAS de forma asimétrica. Como la unión de Ca2+ a ADMIDAS inhibe la unión de integrina-ligando11, la unión asimétrica de Ca2+ daría como resultado una menor inhibición de la integrina en el lado catódico. La integrina unida al ligando forma grupos para enviar señales intracelulares para el enlace integrina-citoesqueleto36,44. La formación de grupos puede verse facilitada por un mecanismo de retroalimentación positiva45, que podría amplificar el efecto eléctrico.

La integrina activada asimétricamente activaría la vía PI3K-Akt de forma asimétrica. Se ha demostrado que la señalización asimétrica de PI(3,4,5)P3 y Akt sirve como regulador temprano durante el giro atractivo de un cono de crecimiento46. Como Akt (PKB) inhibe GSK3β35, la integrina menos inhibida inhibiría más GSK3β en el lado catódico. Dado que GSK3β disminuye los microtúbulos estables para mantener los microtúbulos dinámicos a través de la fosforilación de MAP1B, una mayor inhibición de GSK3β aumentaría los microtúbulos estables en el lado catódico. Por tanto, una menor inhibición de la integrina conduciría a una mayor estabilización de los microtúbulos. En un axón giratorio, los microtúbulos se estabilizan en el lado para girar en el cono de crecimiento y el eje de crecimiento30,47. La estabilización asimétrica de los microtúbulos dirigiría el axón hacia el cátodo (Figura complementaria 12). La fluorescencia de los microtúbulos mostró que la fluorescencia máxima se desplazó catódicamente a la mitad del nivel de intensidad de fluorescencia (Fig. 5m y Fig. 11 complementaria). La línea vertical roja en la figura complementaria 11 indica el centro del nivel medio de fluorescencia, no el centro exacto del axón. Sin embargo, dado que la longitud de la mitad del nivel de fluorescencia es de ~100 píxeles y el tamaño de un píxel es de 14,4 nm, la mitad del nivel de fluorescencia casi cubre el diámetro de un axón. Se encontró una distribución de fluorescencia asimétrica en un punto de inflexión (Figura complementaria 11a), no encontrada en partes rectas (Figura complementaria 11b). Por tanto, es probable que los microtúbulos estén distribuidos asimétricamente en un punto de inflexión de un axón en respuesta a una FE. Otros sustratos para GSK3β, APC y CRMP2 promueven la captura y el ensamblaje de microtúbulos tras la inhibición de GSK3β48. APC y CRMP2 también podrían contribuir a la dirección catódica tras la inhibición asimétrica de GSK3β. GSK3β también actúa como un regulador clave en la migración direccional de células progenitoras neurales49 y microglia50 inducida por EF.

La diferencia en las relaciones dosis-respuesta entre TASC y W1B10 (Fig. 1l) puede deberse a sus epítopos; TASC se une a la región cercana al dominio transmembrana51, mientras que se considera que W1B10 se une al dominio de unión al ligando52. Se podría postular que TASC facilitó la formación de grupos tras la expresión de su epítopo en la conformación abierta unida al ligando, lo que podría promover la adhesión a la laminina25. Por otro lado, W1B10 puede haber facilitado la disociación de la integrina del ligando26. La disociación puede ser necesaria y promover la extensión del axón porque un alto Mn2+ suprimió la extensión del axón (Figura 2 complementaria) y porque Mn2+ anuló la mejora de la extensión del axón por W1B10 (Figura 2g). La disociación e inactivación de la integrina mantendría los microtúbulos dinámicos para el avance del cono de crecimiento. Esta idea podría estar respaldada por el hecho de que la inhibición de PI3K mejoró la extensión basal de los axones de RGC (Figura complementaria 10). En resumen, un axón se extiende de dos maneras: (1) elongación del eje del axón mediante microtúbulos estables y (2) avance del cono de crecimiento mediante microtúbulos dinámicos. TASC habría mejorado el primer proceso al aumentar los microtúbulos estables mediante la inhibición de GSK3β, mientras que W1B10 habría promovido el último proceso al proporcionar microtúbulos dinámicos.

El sistema nervioso central (SNC), incluida la retina, se desarrolla a medida que proliferan las células neuroepiteliales, durante las cuales las neuronas primogénitas extienden los axones que viajan largas distancias, como los axones comisurales y los nervios ópticos53,54. Se desconocen los mecanismos para la correcta orientación de estos primeros y largos axones. Las células neuroepiteliales de forma bipolar generan potenciales positivos en el espacio extracelular en la región basal del neuroepitelio a través de su transporte de sodio apico-basal4,7,8. A medida que estas células proliferan más activamente, aumentando la densidad celular en la porción dorsal del tubo neural55, es probable que el potencial más positivo se establezca en la parte dorsal del neuroepitelio4. De hecho, el mayor potencial se registra en la parte dorsal del neuroepitelio de la retina7, donde las células proliferan más activamente56. Por otro lado, las células ubicadas en la porción ventral de la copa óptica tienen forma triangular3, similar a la célula de la placa del piso en forma de cuña del tubo neural57. Esta morfología implica que estas células ventrales no participan en el transporte de sodio apico-basal. Los canales iónicos de la célula de la placa del suelo no son responsables del transporte de sodio58. Por tanto, el potencial positivo no se genera en la parte ventral del SNC en desarrollo, incluida la retina7. Por lo tanto, la FE resultante está orientada en dirección dorsoventral. Esta FE dirigiría los primeros axones, como se demuestra en la retina7. Las señales de orientación de los axones comisurales siguen siendo enigmáticas; Se plantea una pregunta (-?-) en la figura 4h de datos ampliados de Dominici et al.2, donde “+” indica netrina, “-” indica una supuesta molécula repelente en la región dorsal59,60,61,62. La FE dorsoventral también puede dirigir los axones comisurales hacia la placa del suelo. Como las células neuroepiteliales generan FE durante la neurogénesis, el galvanotropismo puede usarse principalmente en el desarrollo del SNC.

Los huevos fertilizados se compraron a un agricultor local (Instituto Rural Asiático, Nasushiobara, Japón). El protocolo del estudio fue aprobado por el comité de ética animal de la Universidad Internacional de Salud y Bienestar. Una retina neural aislada de un embrión de pollo incubado durante seis días (día embrionario 6, E6) se extendió sobre un filtro de membrana negro (13006-025N, Sartorius) con el lado interno hacia arriba. El conjunto de retina-membrana se cortó en una tira en dirección nasotemporal en el segmento dorsal de 0,7 mm a la cabeza del nervio óptico (Fig. 1a). El tamaño de la tira de retina era de 0,8 mm de ancho y de 2,4 a 2,7 mm de largo (Fig. 1b). Para identificar la dirección original de la tira de retina, el extremo temporal se cortó perpendicularmente a los bordes dorsal y ventral, y el extremo nasal se cortó oblicuo a ellos con el borde ventral más largo. Se colocó un filtro de membrana en forma de cuña entre el borde nasal y la pared del canal de la cámara de cultivo para fijar la tira de retina (Fig. 1b). Era absolutamente necesario que la tira de retina estuviera montada completamente plana. Si la tira de retina se desprendió del filtro de membrana en la periferia durante la incubación, el plegamiento de la retina alteró la dirección de los axones que crecían. La contracción o retracción de la tira de retina desde el borde del filtro de membrana dio como resultado una línea no recta del borde ventral de la tira de retina. Estas retinas fueron excluidas de los datos. La protrusión de masa celular desde la superficie de la tira de la retina provocó extensiones diversas, irregulares y largas de los axones. Estas retinas también fueron excluidas. El protocolo completo para el cultivo de tiras de retina es el siguiente63.

Se añadió DMEM (041-29775, bajo en glucosa con L-glutamina y rojo fenol, FUJIFILM Wako, Osaka, Japón) a 3,6 ml de una mezcla de suero [25 ml de FBS (Biosera) y 5 ml de suero de pollo (Gibco®), almacenado a 4 ˚C] en un tubo cónico de 50 ml de modo que el volumen total fuera de 30 ml (concentraciones séricas finales: FBS 10 %, suero de pollo 2 %). La mezcla de suero se puso en hielo. El tubo cónico se puso en una incubadora seca a 38 ˚C. Ambas paredes de la cubeta (22,0 mm de largo, 3,2 mm de ancho y 2,0 mm de profundidad) de la cámara de cultivo (Φ25, 2 mm de espesor, hecha de un disco acrílico) se recubrieron con grasa de silicona (Dow Corning, HVG ) utilizando una varilla fina (un palillo de madera), que se limpió con Kimwipes® y etanol antes de su uso. Sin el recubrimiento, Matrigel® (356234, Corning®) se adhirió a la pared del comedero. Se fijó firmemente un cubreobjetos (Φ25) a cada lado de la cámara de cultivo con grasa de silicona para formar el fondo de la cubeta. Se colocó una pequeña cantidad de grasa de silicona en la superficie superior de la cámara de cultivo a lo largo de ambas paredes de la cubeta para fijar de forma segura otro cubreobjetos (Φ15) después.

Se colocó una alícuota de Matrigel® (152 μL, almacenada a -20 ˚C) en un refrigerador a 4 ˚C. La alícuota de Matrigel® se puso en hielo después de 30 min. Se añadió una mezcla de suero de 48 µL a Matrigel® (concentraciones séricas finales: FBS 20 %, suero de pollo 4 %). Si se aplicó un medicamento, el medicamento se agregó a Matrigel®. Los sueros que contenían Matrigel® (y el fármaco) se enfriaron en hielo y se homogeneizaron mediante golpecitos. El enfriamiento y el golpeteo se repitieron al menos tres veces. El Matrigel® y un bloque de aluminio (Φ25, 15 mm de espesor) se pusieron en hielo. Se puso un plato de 35 mm sobre hielo y se llenó con DMEM para enfriar una punta de pipeta de 10 µl succionando el DMEM enfriado con hielo antes de succionar Matrigel®.

Los huevos incubados durante seis días se llevaron a una sala limpia. El huevo se puso sobre un soporte para huevos con la cámara de aire hacia arriba. Se rompió la cáscara y se expuso el embrión en una placa de Petri. El cuello se cortó con unas pinzas y la cabeza se recogió y se transfirió a un plato de 35 mm lleno con una solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) modificada sin Ca2+, Mg2+ (H6648, Sigma-Aldrich) usando un anillo (Φ6-7 ) de alambre inoxidable, que se hizo retorciendo un alambre fino de acero inoxidable y conectado a un soporte. Se compararon varias cabezas para la puesta en escena. Se enucleó un ojo bajo un microscopio de disección y se transfirió a otra placa de 35 mm llena de HBSS sujetando la lente con unas pinzas finas. Los músculos extraoculares se eliminaron con un par de pinzas finas. Se hizo un pequeño corte a lo largo del ecuador cerca de la fisura óptica. El ojo se transfirió a otra placa de 35 mm llena de HBSS que contenía un filtro de membrana negro (13006-025N, Sartorius). El epitelio pigmentario se despegó con un par de pinzas finas insertando la punta de las pinzas en la hendidura entre la retina neural y el epitelio pigmentario para separarlos. La cabeza del nervio óptico se cortó con unas pinzas finas. Se extirparon el nervio óptico y el epitelio pigmentario. Se realizó un corte continuo a lo largo del ecuador para separar la retina anterior de la retina posterior. El ojo se colocó sobre el filtro de membrana negro con la lente hacia arriba. Se empujó suavemente el ojo sobre el filtro de membrana de modo que la membrana limitante exterior de la retina posterior quedara unida al filtro de membrana. El cuerpo vítreo fue separado de la retina posterior. La retina posterior se unió al filtro de membrana presionando la periferia del filtro de membrana. El cuerpo vítreo podría separarse de la retina en las partes dorsal, nasal y temporal. Luego, se separó el cuerpo vítreo de la fisura óptica. Se extirpó todo el cuerpo vítreo y la retina anterior junto con el cristalino. Toda la retina posterior se unió al filtro de membrana presionando la periferia del filtro de membrana con unas pinzas finas (Fig. 1a).

El conjunto de membrana de retina se levantó del HBSS y se colocó sobre un papel de filtro (Whatman®, Φ55, 1001-055) con la retina hacia arriba. El papel de filtro se colocó bajo el microscopio de disección para posicionar verticalmente la fisura óptica. Se colocó una escala de acero inoxidable de 15 mm con una escala mínima de 0,5 mm cerca de la retina a la izquierda, en paralelo con la fisura óptica. El nivel de la cabeza del nervio óptico se definió viendo la escala. Se realizó un corte horizontal al nivel de la cabeza del nervio óptico en dirección nasotemporal (es decir, perpendicularmente a la fisura óptica) con un trozo de hoja de afeitar (0,1 mm de espesor, 8 mm de ancho) unido a un portacuchillas. Mediante este corte se definió en la escala el nivel de la cabeza del nervio óptico. Se realizó un corte horizontal 0,7 mm dorsal al corte anterior en paralelo al mismo. Este corte realizó el borde ventral de la tira retiniana. Se realizó otro corte horizontal 0,8 mm dorsal al corte anterior en paralelo a éste. Este corte hizo que el borde dorsal de la tira de retina definiera el ancho de la tira de retina. Se realizó un corte vertical a 1,2 mm a la izquierda de la fisura óptica. Se realizó un corte oblicuo de 1,2 a 1,5 mm hasta la fisura óptica con el borde ventral más largo. Este corte oblicuo definió la dirección de la tira de retina (Fig. 1b). Se adjuntó un trozo de parafilm al fondo de un plato de 35 mm. Se aplicó una gota de DMEM (25 μL) sobre el parafilm. Si se aplicó un fármaco, el fármaco se añadió al DMEM para la preincubación. La tira de retina se transfirió a la gota de DMEM sujetando la esquina inferior derecha de la tira de retina con unas pinzas finas.

El bloque de aluminio enfriado con hielo se puso en una placa de Petri. El espacio alrededor del bloque de aluminio estaba lleno de hielo. La cámara de cultivo se colocó sobre el bloque de aluminio. Se dejó caer un microlitro del suero que contenía Matrigel® enfriado con hielo en el fondo de la cubeta de la cámara de cultivo. El fondo de la artesa se barrió con una fina varilla de tungsteno, que se pulió electrolíticamente, de modo que el fondo quedó recubierto con Matrigel®. Se colocó una cuña de filtro de membrana en el fondo de la cubeta. Esta cuña se utilizó para fijar la tira de retina (Fig. 1b). El conjunto retina-membrana se colocó en el fondo del comedero con la retina hacia arriba. La tira de retina se colocó perpendicularmente a la pared del canal usando la fina varilla de tungsteno. El conjunto de retina-membrana se fijó a la parte inferior reduciendo el espacio entre el conjunto de retina-membrana y la parte inferior para evitar que flote. El borde temporal de la tira de retina estaba adherido a la pared a cada lado del canal en el centro de la misma. La tira de retina se fijó en la cubeta mediante la cuña del filtro de membrana (Fig. 1b). Se succionaron diez microlitros de Matrigel® enfriado con hielo que contenía sueros y se dejaron caer 8 µL sobre la tira de retina dejando 2 µL en la punta de la pipeta de 10 µL para no agregar burbujas de aire. Si se observaron burbujas de aire en Matrigel®, se eliminaron con la fina varilla de tungsteno. Se colocó un cubreobjetos (Φ15) sobre la tira de retina y se fijó firmemente a la superficie superior de la cámara de cultivo con grasa de silicona. La cámara de cultivo se colocó en una cámara termostática humidificada a 37 ˚C para gelificación. También se podría gelificar antes de dejar caer 8 μl de Matrigel® para evitar que la tira de retina se desprenda del filtro de membrana. Después de cinco minutos de gelificación, la cámara de cultivo se colocó sobre un papel amarillo (Φ25), que se colocó sobre un disco acrílico (Φ30, 10 mm de espesor) para una fácil separación de la cámara de cultivo del disco acrílico después de la incubación. Para la separación se utilizaron los papeles amarillos entre filtros de membrana negros almacenados en una caja de plástico. Se sacó de la incubadora seca el tubo cónico de 50 ml que contenía DMEM con 10% de FBS y 2% de suero de pollo. La cubeta de la cámara de cultivo se llenó con DMEM (aproximadamente 100 μl) utilizando una pipeta Pasteur de vidrio pulida al fuego. El DMEM se inyectó cuidadosamente desde cualquier extremo del canal para evitar burbujas de aire. El disco acrílico con la cámara de cultivo se colocó en un pocillo de esquina de una placa de cultivo de 6 pocillos. Los dos pocillos vecinos se llenaron con un exceso de volumen (14 ml) de DMEM que contenía 10 % de FBS y 2 % de suero de pollo para evitar cambios en la composición del medio alrededor de la célula debido a la electroforesis. Ambos extremos del canal se unieron a los pocillos vecinos llenos con DMEM mediante el uso de un par de tubos de vidrio en forma de U (Φ3) completamente llenos con el medio de cultivo para evitar burbujas de aire. Los dos pocillos llenos con el medio de cultivo se conectaron utilizando otro par de tubos de vidrio en forma de U (Φ3) llenos con agar-solución salina al 1% a los dos pocillos vecinos, que se llenaron con DMEM tamponado con HEPES 25 mM (048-30275). , glucosa alta con L-glutamina y rojo fenol, FUJIFILM Wako). Así, se utilizaron cinco pozos para un flujo de corriente. El pozo restante se llenó con agua destilada para mantener la humedad. Se inyectó agua destilada (1 ml) en el pocillo que contenía la cámara de cultivo alrededor del disco acrílico. La placa de cultivo de 6 pocillos se puso en un frasco hermético (2,5 litros de volumen). Se puso un paquete de AnaeroPack®·CO2 (Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc., Tokio) en el frasco hermético. AnaeroPack®·CO2 produce CO2 y mantiene un 5% de CO2 en un tarro hermético durante al menos 150 h. La tapa del frasco hermético estaba cerrada. El frasco hermético se puso en una incubadora seca a 38 ˚C y se incubó durante 24 h.

El sistema de cultivo para proporcionar un EF constante contenía electrodos de ánodo y cátodo para el suministro de corriente y un par de electrodos de micropipeta de vidrio para registrar voltajes en el medio de cultivo. La cantidad de corriente suministrada al medio de cultivo se reguló mediante un circuito de retroalimentación negativa para mantener la diferencia de voltaje entre los dos puntos (15 mm de distancia) a lo largo del flujo de corriente en el valor deseado (225 mV para 15 mV/mm). El protocolo completo para el cultivo constante de FE es el siguiente64.

Los electrodos de disco de Ag/AgCl del ánodo y del cátodo (Φ15-25) se colocaron en los dos pocillos llenos de DMEM tamponado con HEPES. Los electrodos para monitorear los voltajes en el medio de cultivo se fabricaron a partir de un tubo de vidrio Φ3 calentándolo sobre un fuego pequeño y tirando de él hasta que el diámetro de la punta llegó a ser de 0,3 mm. La punta y el borde cortado de la pipeta de vidrio fueron pulidos al fuego. Los electrodos de la pipeta de vidrio se llenaron con agar-solución salina al 1% utilizando un tubo de silicona (Φ2,5 interior) y una jeringa de 2,5 ml. Se insertó un pequeño gránulo de Ag/AgCl (Φ1) que contenía un alambre de Ag/AgCl en los electrodos de la pipeta de vidrio. El alambre de Ag/AgCl se soldó a un alambre de cobre. Esta unión se cubrió con resina epoxi para evitar el contacto con el gel de agar-sal. El cable conductor se conectó a la entrada de un seguidor de voltaje. Se utilizó un amplificador operacional LMC662CN (Texas Instruments) para el seguidor de voltaje porque la resistencia de entrada era superior a 1 TeraΩ y la corriente de polarización era de 2 fA. Para minimizar la longitud del cable conectado al electrodo del monitor y al seguidor de voltaje, el LMC662CN se colocó cerca de la cámara de cultivo en el frasco hermético. Los cables de los electrodos del ánodo y del cátodo, las salidas de los dos seguidores de voltaje y la fuente de alimentación del LMC662CN se conectaron a los conectores fijados a la pared del frasco hermético con grasa de silicona. Los electrodos del monitor se prepararon justo antes de la preparación de la tira de retina. Los electrodos del monitor se limpiaron en agua hirviendo después de cada uso.

Los dos electrodos del monitor se insertaron en el medio de cultivo en el canal en ambos bordes del cubreobjetos superior (Φ15) para mantener la distancia entre los dos electrodos del monitor a 15 mm. Se fabricó un portaelectrodos a partir de una caja acrílica con dos orificios (Φ3,2). La diferencia de voltaje entre los dos puntos se monitoreó continuamente utilizando un amplificador diferencial. La salida del amplificador diferencial se conectó a la entrada inversora (-) de un amplificador operacional (BB3582J, Burr-Brown). Se utilizó BB3582J debido a su amplio rango de voltaje de funcionamiento (±115 V). Se utilizó un voltaje de referencia (Vref) para regular la diferencia de voltaje entre los dos puntos mediante el circuito de retroalimentación negativa. Vref se conectó a la entrada no inversora (+) de BB3582J. La corriente de retroalimentación fluyó a través del medio de cultivo entre los dos electrodos del monitor, las resistencias totales de los electrodos de ánodo y cátodo, los puentes de agar-sal, los tubos de vidrio que contienen el medio de cultivo y las soluciones conectadas a ellos, y la resistencia de retroalimentación ( RF). Rf se ajustó utilizando una resistencia variable (0,1–1,0 MΩ). La salida del amplificador diferencial igualó a Vref tras la retroalimentación negativa del amplificador operacional. La tensión de compensación del amplificador diferencial, incluidas las compensaciones de los dos electrodos monitores y los dos seguidores de tensión, se anuló restando la tensión de salida registrada durante períodos sin corriente de 0,5 s en un intervalo de 100 s (ciclo de trabajo, 99,5 %). . El flujo de corriente se interrumpió mediante un interruptor de relé accionado por impulsos. La salida del amplificador diferencial se registró continuamente con un registrador gráfico (PowerLab 2/26, ADInstruments) durante todo el período de incubación para comprobar que todos los componentes funcionaban correctamente. Dado que la amplitud de corriente para mantener una intensidad de EF de 15 mV/mm fue de alrededor de 180 μA (150–200 μA), se estimó que la resistencia específica del medio de cultivo era de ~53 Ωcm.

Para la preparación de la tira de retina se utilizó una solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) modificada sin Ca2+, Mg2+ (H6648, Sigma-Aldrich). Se incrustó una tira de retina en 8 μl de Matrigel® (356234, Corning®) que contenía 20 % de FBS (Biosera) y 4 % de suero de pollo (Gibco®). El recipiente de la cámara de cultivo (100 μl de volumen) se llenó con DMEM (041-29775, bajo contenido de glucosa con L-glutamina y rojo fenol, FUJIFILM Wako, Osaka, Japón) que contenía 10 % de FBS y 2 % de suero de pollo. Ambos extremos de la cubeta se conectaron a los pocillos vecinos llenos con el mismo medio de cultivo con exceso de volumen (14 ml) mediante el uso de un par de tubos de vidrio llenos con el medio de cultivo. Se añadió suspensión de penicilina-estreptomicina-anfotericina B (161-23181, FUJIFILM Wako) al medio de cultivo al 1%. Los electrodos de ánodo y cátodo se colocaron en los otros pocillos llenos de DMEM tamponado con HEPES 25 mM (048-30275, glucosa alta con L-glutamina y rojo fenol, FUJIFILM Wako).

Las células vivas y los axones se tiñeron con calceína-AM (10 μM, DOJINDO) en DMEM (044-32955, glucosa alta con L-glutamina, tampón HEPES, sin rojo fenol, FUJIFILM Wako) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se utilizaron un escáner confocal tipo Nipkow (CSU10, Yokogawa, Kanazawa, Japón), una cámara sCMOS (ORCA®-Flash4.0 V2, Hamamatsu photonics, Hamamatsu, Japón) y un software HSR (Hamamatsu) para obtener imágenes de fluorescencia. La tasa de extensión ventral (VER) se obtuvo mediante la relación de la intensidad de fluorescencia media entre las líneas ventrales de 150 μm y 400 μm a la tira retiniana a lo largo de todo el borde ventral contra la intensidad de fondo medida en el área sin retina (Fig. 1c, d). Las fotografías para la medición VER se tomaron con un objetivo ×4 al nivel de la capa RGC, lo que proporcionó imágenes representativas. ImageJ se utilizó para medir las intensidades medias de fluorescencia en un rango de 0 a 255. La intensidad del fondo se ajustó a alrededor de 21 utilizando Photoshop® Elements.

TASC (MAB19294) y W1B10 (I8638) se adquirieron de Millipore y Sigma, respectivamente. Se adquirió un anticuerpo monoclonal de control de isotipo IgG1 de ratón M075-3M2 (grado funcional) de MBL (Nagoya, Japón). Se aplicó TASC a 20, 50, 100, 200 μg/ml. Se aplicó W1B10 a 10, 20, 50, 100, 200 μg/ml. Se aplicó M075-3M2 a 100, 200 μg/ml. Las tiras de retina se preincubaron en una gota de DMEM (25 μl) que contenía el anticuerpo en Parafilm® durante 10 minutos. Dado que los anticuerpos se presentaron en tampón fosfato, las disminuciones en Ca2+ y Mg2+ libres debido al tampón fosfato se compensaron agregando CaCl2 y MgCl2 al medio de preincubación y Matrigel® en una proporción de 4 (tampón fosfato): 2 (CaCl2): 1 (MgCl2). Se disolvió LY2090314 (Selleck) en DMSO a 10 mM como solución madre y se diluyó a 1 mM para obtener una alícuota de 25 μl. Se disolvió SC79 (Selleck) en DMSO a 25 mM como solución madre. Se disolvió omipalisib (GSK2126458, GSK458, Selleck) en DMSO a 5 mM como solución madre. Se disolvió citocalasina D (Cayman Chemical) en DMSO a 1 mg/ml como solución madre. Se disolvió sal de potasio CalbryteTM-520L (20642, AAT Bioquest®) en agua destilada a 10 mM que contenía CaCl2 1 mM. Se disolvió nocodazol (FUJIFILM Wako) en DMSO a 10 mg/ml como solución madre.

Se aislaron copas ópticas de pollitos E4. Se eliminaron el cristalino y el epitelio pigmentario. Toda la retina neural se incubó durante 24 h en DMEM que contenía 20% de FBS y 4% de suero de pollo. Después de la incubación, la retina se extendió sobre un filtro de membrana negro con el lado interior hacia arriba o en el fondo de una cámara de grabación con un par de agujas de tungsteno en forma de L.

Se cultivaron tiras de retina de pollitos E6 durante 48 h. El lado ventral de la tira de retina estaba frente al lado abierto de un chip de microfluidos en forma de abanico (Figura complementaria 3, SOKEN, Ome, Japón). Estaba hecho de una placa acrílica (3,0 mm de ancho, 2,0 mm de largo, 0,8 mm de espesor). Su ángulo de apertura era de 160°. En el centro se cavó el canal central (0,2 mm de ancho, 0,5 mm de profundidad) para el flujo de corriente. Se colocó en la cubeta (3,2 mm de ancho) de una cámara de cultivo de 1,0 mm de espesor. Todos los huecos se rellenaron con grasa de silicona para que la corriente fluyera sola a través del canal. Se aplicó una corriente constante desde un amplificador de alto voltaje con un voltaje de salida constante (115 V) a través de una resistencia (2, 20, 200 MΩ). Matrigel® y el medio de cultivo contenían 20% de FBS y 4% de suero de pollo. Se añadió W1B10 (100 μg/ml) al medio de preincubación y Matrigel® para mejorar los efectos eléctricos.

Se fabricó una cámara de cultivo que contenía un microcanal a partir de un disco acrílico (25,0 mm de diámetro, 1,0 mm de espesor, SOKEN, Ome, Japón). El ancho del microcanal fue de 0,2 mm, la longitud y la profundidad fueron de 1,0 mm (Figura complementaria 5a). Se concentró una corriente en el microcanal entre las paredes arqueadas para que fluyera hacia el cátodo. Se cultivaron tiras de retina de pollitos E6 durante 48 h. La longitud del borde ventral de las tiras de retina fue de 2,2 mm y el ancho de 0,8 a 1,0 mm. El borde ventral de la tira de retina estaba frente al microcanal a una distancia de 0,4 mm (Figura complementaria 5b). Las esquinas nasal y temporal del borde ventral de la tira retiniana hicieron contacto con la pared arqueada de la cámara del microcanal. Se aplicó una corriente constante desde una fuente de corriente constante (GS200, Yokogawa). Matrigel® y el medio de cultivo contenían 20% de FBS y 4% de suero de pollo. El ángulo de convergencia (CA) se midió utilizando ImageJ entre dos axones que se extienden rectos (≥100 μm) desde las regiones más nasales y temporales de la tira retiniana hacia el microcanal. No se utilizaron axones sigmoideos o curvos. Se crearon perfiles transversales de intensidades de fluorescencia en la línea de media distancia entre la retina y el microcanal a partir de imágenes tif originales utilizando ImageJ. El valor mínimo de intensidad de fluorescencia se restó como fondo. El FCA se obtuvo de la suma total del perfil transversal. Las fotografías para las mediciones de CA y FCA se tomaron con un objetivo de ×10 al nivel de la capa RGC.

Se diseccionaron tiras de retina (~ 2,5 mm × 2,5 mm) desde el segmento de 0,7 mm dorsal a la cabeza del nervio óptico de la retina de pollo E6 en un filtro de membrana negro con el lado interno hacia arriba. La tira de retina se enfrió en DMEM sobre hielo y se transfirió a la cámara de cultivo para un cultivo EF constante. Se empapó en 2,5 µL de Matrigel® que contenía 20 % de FBS y 4 % de suero de pollo. La capa superficial de la retina se raspó y se extendió en el fondo de la cámara con un pincel fino, cuyo diámetro del mechón de cabello fue de 0,5 mm (GH-BRSUP-GT, GodHand, Tsubame, Japón). La cámara de cultivo se colocó en una cámara termostática humidificada a 37 ˚C durante 5 minutos para gelificar. Luego, se llenó con DMEM que contenía 20% de FBS y 4% de suero de pollo y se incubó durante 24 h.

La capa delgada de Matrigel® que contenía masas celulares se lavó cinco veces con una solución salina equilibrada de Hanks modificada sin Ca2+, Mg2+ (H6648, Sigma-Aldrich). Se fabricó una micropipeta a partir de un capilar de vidrio de borosilicato que contenía un filamento (GC150F-10, Harvard Apparatus) utilizando un extractor (P-97, Sutter Instrument). La micropipeta se llenó con CalbryteTM-520L 10 mM (20642, AAT Bioquest®) que contenía CaCl2 1 mM y se manipuló utilizando un sistema de posicionamiento piezoeléctrico (PCS-1000, Burleigh Instruments). La corriente para entregar CalbryteTM-520L (-200 nA) se suministró desde una fuente de corriente constante (GS200, Yokogawa). Para aplicar un EF de ~15 mV/mm, se suministró una corriente constante de 180 μA desde un amplificador de alto voltaje con un voltaje de salida constante (115 V) a través de una resistencia variable (0,1–1,0 MΩ) con un par de tubos de polietileno. electrodos (Φ 1 mm) que contienen 1% de agar salino.

El sistema de microscopio confocal de gran aumento (Fig. 13 complementaria) se utilizó para el registro de fluorescencia de Ca2+ y la obtención de imágenes de fluorescencia de citoesqueletos. Contenía un intensificador de imágenes (C9016-01, Hamamatsu) y una fuente láser de alta potencia (473 nm, 150 mW, 06-MLD, 0473-06-03-0150-100, Cobolt). Se capturaron imágenes de fluorescencia de Ca2+ a una velocidad de 10 fps (tiempo de exposición: 100 ms). Se utilizó el software HCImage Live (Hamamatsu) para capturar y analizar imágenes de fluorescencia de Ca2+. ImageJ se utilizó para obtener perfiles transversales y medir el ángulo de los axones.

El reactivo TubulinTrackerTM Green (Oregon GreenTM 488 Taxol, bis-acetato, T34075, Invitrogen) (Componente A) se disolvió en 71 μl de DMSO para preparar una solución madre de 1 mM. Se mezclaron diez microlitros del Componente A con 10 µL del Componente B (20 % de Pluronic F-127 en DMSO) para preparar una solución madre intermedia de 500 µM. Se disolvieron diez microlitros de la solución madre intermedia en 10 ml de DMEM (tamponado con HEPES, sin rojo de fenol) para preparar una solución de trabajo de 500 nM. Las tiras de retina se tiñeron con la solución de trabajo durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Se utilizó faloidina fluorescente Acti-stainTM 488 (PHDG1, Cytoskeleton). Se diluyeron cincuenta microlitros del reactivo (14 μM) en 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4, Nacalai Tesque) para preparar una solución de trabajo de 140 nM. Las tiras de retina se fijaron en una solución fijadora (paraformaldehído al 4% en PBS, Nacalai Tesque) durante 10 minutos y se permeabilizaron en un tampón de permeabilización (Triton X-100 al 0,05-0,1% en PBS) durante 5 minutos. Luego se tiñeron con la solución de trabajo durante 30 min. Todos los procedimientos se realizaron a temperatura ambiente.

Se hizo una tira de retina a partir de una retina. El número de tiras de retina analizadas es igual al número de experimentos independientes. Se tomaron seis fotografías de una tira de retina y se promediaron los datos totales de múltiples tiras de retina para cada condición experimental. Se aplicó la prueba t de dos colas a todas las comparaciones estadísticas. Se evaluaron diferencias estadísticamente significativas cuando P <0,001 (**) o <0,01 (*). Todos los hallazgos experimentales presentados en este estudio fueron replicables.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable. Los datos fuente numéricos para las Figs. 1d, k, l, 2g, 3d – f, 4d – g, 5i, j, m se proporcionan en los Datos complementarios 1.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Investigación de Espina Bífida e Hidrocefalia de Japón (JSBHRF), la Fundación de Investigación Ocular para Ancianos (ERFA), la Fundación Suzuken Memorial, la Fundación Naito, Novartis Alcon, JSPS KAKENHI JP25460298, JP18K06857, JP21K06772.

Universidad Internacional de Salud y Bienestar, Ohtawara, Japón

Masayuki Yamashita

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MY contribuyó al diseño e implementación de la investigación, a la obtención de financiación, al análisis de los resultados y a la redacción del manuscrito.

Correspondencia a Masayuki Yamashita.

El autor no declara intereses en competencia.

Communications Biology agradece a Soumyajit Dutta y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales: Ivo Lieberam y George Inglis. Un archivo de revisión por pares está disponible.

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Yamashita, M. Guía del axón eléctrico mediada por integrinas que subyace a la formación del nervio óptico en la retina embrionaria de pollo. Común Biol 6, 680 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05056-x

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Recibido: 08 de septiembre de 2022

Aceptado: 20 de junio de 2023

Publicado: 30 de junio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05056-x

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